转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)介导的HT1080RIP1-/-细胞株和MDA-MB-231RIP1-/-细胞株构建
目前常用的基因敲除/敲减技术包括针对mRNA操作的RNA干扰(RNAi)技术、和针对基因组操作的锌指核酸酶技术(Zinc-Finger Nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶技术(Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN)和最近几年发展起来的CRISPR/Cas9(Clustered Regμlarly InterspacedShort Palindromic Repeats RNA)技术等。其中TALEN技术具有特异性好、打靶效率高、操作便捷等优点，广泛应用在动植物真核细胞和胚胎基因组精确修饰领域。 具有丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶活性的受体相互作用蛋白(receptor-interactingprotein1，RIP1)在调控细胞凋亡和细胞坏死性凋亡中占据重要地位。RIP1包含C末端磷酸激酶活性区(kinase domain，KD)、N末端死亡结构域(death domain，DD)和中间区域(intermediate domain，ID)。ID区域含有RIP同型相互作用域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)。RIP1与RIP3通过RHIM域间相互作用结合形成复合体启动细胞坏死性凋亡过程。作为一个重要的衔接蛋白，RIP1通过DD区域的同型相互作用(homotypic interaction)与多种细胞表面受体（如TLR3、TLR4、TNFR1和Fas等）组装成细胞死亡信号复合体。此外，RIP1磷酸激酶活性被抑制时细胞坏死性凋亡也被抑制，显示RIP1磷酸激酶活性对细胞坏死性凋亡的重要性，但其分子机制尚不明确。因此，利用TALEN技术构建RIP1缺陷型细胞株，对深入研究RIP1在细胞死亡的调控机制和肿瘤细胞耐药的分子机制等方面有着极为重要的意义。 本论文以人纤维肉瘤细胞HT1080和人乳腺癌细胞MDA-MB-231为改造对象，构建针对RIP1的TALEN质粒并导入细胞株中，通过药物筛选和单克隆筛选获得HT1080RIP1-/-细胞株和MDA-MB-231 RIP1-/-细胞株，进而利用基因测序、Western blot等方法从基因组DNA和蛋白质等水平进行确证。结果包括: 1 针对人RIP1 CDS序列的TALEN构建及活性鉴定:针对RIP1的CDS区域选取设计了2个打靶位点，通过TALEN模块组装方法构建了10个TALEN左右臂质粒。经过酶切初步检测其构建情况后进行了HEK293T细胞试转染，结果显示其转染效率高达40％。为了进一步确认构建出的TALEN质粒的打靶活性，又对转染后的293T细胞进行了测序验证，结果显示最终得到了L1R1左右臂TALEN质粒组合成功进行了RIP1基因的敲除。 2 TALEN介导的HT1080RIP1-/-细胞株构建与筛选:利用成功构建并经活性验证的TALEN打靶组合L1R1左右臂开展了对人纤维肉瘤细胞HT1080的RIP1基因敲除和单克隆HT1080RIP1-/-细胞株筛选。HT1080转染率约15％，通过单克隆筛选得到了1株转染后的单克隆株并通过基因组测序和Western blot确证。 3 TALEN介导的MDA-MB-231细胞RIP1基因敲除:进而利用L1R1打靶质粒组合对人乳腺癌MDA-MB-231细胞RIP1进行了敲除实验。MDA-MB-231细胞系转染率经流式细胞术检测约13％，然后单克隆筛选得到了1株转染后的单克隆株，经基因组测序和Western blot验证成功得到了一株MDA-MB-231RW1-/-细胞。 本文运用TALEN基因编辑技术在细胞水平上对RIP1基因进行基因敲除，为RIP1在细胞死亡过程中磷酸化状态研究提供了细胞模型和材料基础，并为最终阐明RIP1在细胞死亡通路中的作用奠定基础，以期为肿瘤的相关病理学研究提供可信的理论支持，以及临床抗肿瘤药物的研发提供合理的参考意义。
肿瘤细胞;受体相互作用蛋白;转录激活因子样效应物核酸酶技术
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
樊廷俊
2015
中文
R730.21
99
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）