基于牛胶原蛋白复合支架的组织工程人前板层半角膜的体外构建及其鉴定研究
角膜(Cornea)位于眼球表面，为眼睛提供大部分屈光力，在维持人眼视功能中具有重要作用。角膜由于直接与外界环境接触，故极易受到损伤和感染，造成视力下降甚至致盲。人角膜的组织结构包括角膜上皮层(human cornealepithelium，HCEP)、前弹力层、基质层(human corneal stroma，HCS)、后弹力层和内皮层(human corneal endothelium，HCE)。其中，HCEP由多层HCEP细胞组成，在维持角膜结构的完整性以及保护角膜免受损伤和感染方面具有重要作用;HCS由200余层规则排列的胶原板层和散在分布于其中的HCS细胞组成，在维持角膜厚度和透明度方面作用重大。角膜位于眼表的最外侧，最容易受到损伤和感染，在受到深度的创伤、灼伤和感染后，既会损伤HCEP又会伤及HCS，而且表层HCEP的损伤往往还会波及到其内侧的HCS，故前半层角膜损伤和病变的几率很高。目前，前半层角膜病变治疗的理想手段就是进行前半层角膜移植手术，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者无法通过角膜移植手术复明。近年来，随着角膜组织工程的兴起和发展，体外构建的组织工程人前板层半角膜(tissue-engineered human anterior hemi-cornea，TE-aHC)可作为捐献角膜的等效替代物，为前半层角膜病变患者的临床治疗带来希望，并已成为解决供体角膜不足的一种新的可行途径。 在TE-aHC的体外构建中，足量功能正常的种子细胞和生物相容性良好的载体支架是两大关键因素。但目前TE-aHC的相关研究甚少，所使用的种子细胞一般为永生化的角膜组织细胞系，或原代培养的角膜组织细胞，虽然仍具有细胞原有的特点，但因具有潜在致瘤性或数量有限从而限制了TE-aHC的体外构建研究，尤其是其临床应用。而目前所用的载体支架材料主要有脱细胞猪角膜基质和重组人源胶原蛋白复合支架，虽然它们均具有较为理想的生物相容性，但因脱细胞猪角膜基质存在有来源、宗教和病原体携带风险问题，而重组人源胶原蛋白复合支架价格昂贵和韧性欠佳等问题，在很大程度上限制了其大规模应用。此外，在TE-aHC的体外构建研究中，还存在有种子细胞接种后分布不均一、所构建TE-aHC一体性较差等问题，也在很大程度上制约了TE-aHC的体外构建。由于采用非酶解法提取的牛胶原蛋白具有完整的胶原分子结构，不仅来源广泛、有效避免了宗教伦理问题，而且在其提纯过程中可以实现动物可能携带病原体的完全去除，能有效解决动物源性生物材料的安全问题，因此，本文选用牛胶原蛋白和硫酸软骨素进行TE-aHC复合支架的制备，进而以其为载体支架、以非转染无致瘤性人角膜组织细胞系为种子细胞，首次利用“三明治”法联合血纤蛋白交联技术，进行了TE-aHC的体外构建研究。 为了制备出生物相容性良好的牛胶原蛋白-硫酸软骨素(bovinecollagen-chondroitin sulfate，BCOL-CS)复合支架，本文首次利用从牛跟腱中分离纯化出的非酶解、完整分子胶原蛋白，制成130 mg/mL牛胶原蛋白溶液后进行冻干，以EDC/NHS为交联剂并添加硫酸软骨素对所得牛胶原蛋白冻干薄片进行化学交联，然后对其性质和组织结构进行检测。结果显示，所制备出的BCOL-CS复合支架光学透明度高，透光率为62.55-93.04％，厚度约为90.2±10.7μm，含水量约77.45±4.44％，支架表面平整、呈致密网状结构，支架内部胶原纤维排列规则、紧密，表明利用纯化牛胶原蛋白制备的复合支架与天然角膜的光学透明度、含水量及板层结构相似，可以作为载体支架用于TE-aHC的体外构建研究。 为了获得TE-aHC体外构建的种子细胞，本文又对业已建立的非转染HCEP细胞系和HCS细胞系细胞进行了体外扩增培养和鉴定。光镜的形态观察结果显示，85代HCEP细胞和第28批第63代HCS细胞分别呈多角形铺路石样和纤维样的细胞形态;生长曲线结果发现，HCEP细胞和HCS细胞的群体倍增时间分别为40.1 h和43.6 h;染色体分析结果证实，这两种细胞的特征染色体数目均为2n=46条;免疫细胞化学染色结果显示，HCEP细胞能够表达标志蛋白角蛋白3/12以及功能蛋白——紧密连接蛋白、整联蛋白β1、间隙连接蛋白43、乙醛脱氢酶、钠钾泵和钙泵;HCS细胞能够表达标志蛋白波形蛋白以及功能蛋白——整联蛋白β1、间隙连接蛋白43、乙醛脱氢酶、钠钾泵和钙泵。上述结果证实，体外扩增培养的HCEP细胞和HCS细胞仍然保持有原有细胞的形态、种属特征、增殖活性以及发挥形成细胞连接和膜运输功能的正常潜能，能够作为种子细胞进行TE-aHC的体外构建研究。 本文以BCOL-CS复合支架为载体支架、以扩增培养的非转染HCS细胞和HCEP细胞为种子细胞，利用“三明治”法联合血纤蛋白交联技术，进行了TE-aHC的体外构建研究。在所制备的BCOL-CS复合支架上接种HCS细胞，利用“三明治”法联合血纤蛋白交联技术将4层已接种HCS细胞的支架叠置，进而在已获得HCS样结构的表面接种HCEP细胞，气-液交界培养5d构建出TE-aHC。对其理化性质、组织结构和潜在功能的检测结果显示，体外构建的TE-aHC光学透明度高，透光率为19.85-90.85％; HCS细胞均匀分布于BCOL-CS复合支架之间，HCEP细胞形成了完整连续的4-6层复层上皮结构，HCEP细胞和HCS细胞仍然保持有其标志蛋白及功能蛋白的阳性表达。所有这些结果表明，本文体外构建出的TE-aHC具有与活体角膜的前半层高度相似的理化性质、细胞属性、组织结构和功能蛋白表达模式，具有发挥前半层角膜正常功能的潜力。 综上所述，本文首次以非酶解、完整分子的牛胶原蛋白为主要材料制备出BCOL-CS复合支架，进而以其为载体支架、以非转染HCEP细胞和HCS细胞为种子细胞，利用“三明治”法联合血纤蛋白交联技术，成功体外构建出了与活体人角膜形态结构近似、仍保持有发挥前半层角膜潜在功能的TE-aHC，有望作为捐献角膜的有效替代物用于前半层角膜异常患者的临床移植和治疗。
人前板层半角膜;体外构建;牛胶原蛋白复合支架;制备工艺
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
樊廷俊
2015
中文
TB347
72
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）