文昌鱼抗菌肽基因的鉴定和功能研究
文昌鱼是一种重要的模式生物，被认为是从无脊椎动物到脊椎动物间的过渡物种，有着重要的进化地位。抗菌肽是构成生物体先天性免疫的重要组成成分，能快速高效杀死入侵病原体，也是目前应对由于抗生素滥用所引起的细菌抗药性问题的重要替代途径之一。本文以青岛文昌鱼为研究对象，成功从其cDNA文库中鉴定出一种新型抗菌肽基因，并对组织分布，以及编码的成熟肽的功能及其抑菌机制进行研究。 本文依据进化关系较近物种间抗菌肽基因所编码的前体肽的信号肽序列高保守性这一特点，以盲鳗（Myxine glutinosa）抗菌肽HFIAP-1的信号肽为检索条件，通过生物信息学分析，在佛罗里达文昌鱼数据库中确定了一条预测的抗菌肽基因序列，并从青岛文昌鱼cDNA文库中成功克隆出目标抗菌肽基因Bjamp1的完整ORF，化学合成其编码的成熟抗菌肽多肽段mBjAMP1，研究了mBjAMP1的抑菌功能，并对其抑菌机制和溶血性、细胞毒性进行了探索。 通过生物信息学分析，我们确定了青岛文昌鱼的一条抗菌肽目标序列Bjamp1，采用PCR及RACE技术成功克隆出该基因完整ORF。组织分布表明，Bjamp1主要在肠、鳃、肝盲囊、肌肉、脊索中大量表达，而在精巢和卵巢中表达较少。经LPS/LTA处理后，其表达量在脊索、肌肉、肝盲囊中的表达量显著升高，表明Bjamp1可能参与到了文昌鱼的免疫反应之中。 Bjamp1的完整ORF长294 bp，编码一条包含97个氨基酸残基的多肽链;经分析，该多肽链氨基端的前24个氨基酸残基构成信号肽，中间为一段阴离子富集区，羧基端为一阳离子富集区。经预测，成熟抗菌肽为位于R75R76双碱性氨基酸残基剪切位点之后的由21个氨基酸残基构成的多肽段，并命名为mBjAMP1，其分子质量为2.5 KDa，等电点为11.6，疏水性氨基酸残基比例为38％，静电荷为+6，含有两段α螺旋结构。采用化学合成法合成了该21氨基酸残基构成的多肽段mBjAMP1，并对其羧基端进行了酰胺化处理。 通过圆二色性光谱(CD)实验证明，在PBS溶液中，mBjAMP1以一种无规卷曲的构象存在，而处于SDS，三氟乙醇(TFE)这些细菌细胞膜模拟环境中时，则呈现出a螺旋构象，这表明，mBjAMP1在与细胞膜接近时，可能经历了一个由无规卷曲向a螺旋的构象转变过程。 抑菌实验表明，mBjAMP1对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均具有抑菌效果，实验中各种细菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为:金黄色葡萄球菌（S.aureus）6.3μg/ml、藤黄微球菌（M.Luteus）6.3μg/ml，大肠杆菌(E.coli)6.3μg/ml、鳗弧菌（V.anguillarum）12.5μg/ml。 细胞膜的去极化实验结果显示，mBjAMP1可引起大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的去极化作用，且引起去极化的速度和程度呈现浓度依赖性。这表明mBjAMP1在发挥抑菌功能时，会作用于细菌的细胞膜上，引起细菌细胞膜上电位的改变，从而导致去极化作用的发生。 细胞膜通透性改变实验中，被mBjAMP1处理后的细菌细胞膜的通透性相对于未处理组有显著增加，且呈现出浓度依赖性。这表明，mBjAMP1作用于细菌时，破坏了其细胞膜的完整性，使其通透性增加，进而抑制细菌的生长繁殖，进而导致细菌的死亡。 酶联吸附试验(ELISA)证明mBjAMP1能够与病原分子模式LPS、LTA特异性结合，其可能是一种病原分子模式识别受体。在透射电镜实验中我们观察到，细菌的细胞壁遭到了严重破坏，细胞质变得透明化，同时，细菌细胞膜表面不再平滑，在处理组的金黄色葡萄球菌细胞膜表面出现多处明显凹陷的小洞。这表明mBjAMP1与细菌作用时，破坏了细菌的细胞壁，并可能在细胞膜上形成孔洞。溶血实验和细胞毒性实验（MTT比色法）表明，mBjAMP1不具有溶血性和细胞毒性。 综上，我们判定，Bjamp1是青岛文昌鱼的一个抗菌肽基因，由其编码的成熟肽mBjAMP1是一个对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有抑菌效果，通过破坏细胞膜完整性的方式发挥抑菌活力，且无溶血性和细胞毒性的阳离子抗菌肽。
文昌鱼;抗菌肽基因;克隆技术;抑菌功能
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
张士璀;汲广东
2015
中文
Q959.287
79
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）