海洋微藻DNA条形码基因的评估及环境样本多样性分析和定量基因的开发
海洋微藻不仅在海洋生态系统中占有十分重要的生态地位，而且其结构成分和分泌物等是巨大的可开发利用的海洋资源，而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要类群，因此，对其进行准确地分类鉴定是其他相关工作的研究基础。DNA条形码技术作为传统分类学鉴定的补充手段发挥了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA条形码研究起步较晚，尚未找到分别适合的统一的DNA条形码基因，现有的研究也主要是分别针对特定的分类单元进行条形码基因的检测，并未在整个类群上对候选基因进行过评估。此外，目前对海洋微藻群落结构的研究，一是显微镜检，但该方法受限于形态学鉴定的局限性，二是利用rDNA的扩增子测序信息来反映群落中微藻的组成结构，但rDNA在不同真核生物中的的拷贝数差异很大。因此根据rDNA扩增子测序所得的序列丰度对环境样本中真核微生物群落的相应物种的丰度评估可能存在误差。一些拷贝数较少的核编码的蛋白基因已被用于甲藻的系统发育分析，将此类基因用于群落结构分析，结果应该会更加准确。 因而，本文针对研究较为广泛的硅藻，对选取的候选条形码基因18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL，分别进行通用引物的设计和验证，联合NCBI上的序列计算硅藻门各基因的遗传差异并构建贝叶斯树，评估其在硅藻门内物种的聚类情况，以分析各段标记适用于硅藻聚类关系中的分类单位;然后利用硅藻模拟混合样本进行rDNA扩增子克隆测序，评估rDNA序列的丰度反应环境样本中真核微生物群落的相应物种丰度的准确性;并对具有一定的甲藻物种区分能力的拷贝数较低的核编码蛋白基因（HSP90、elf2、actin）设计通用引物，分析其对甲藻物种的区分度后，利用甲藻模拟群落和选定的actin基因构建克隆文库初步评估该基因对甲藻物种进行定量的准确性;最后比较18S v9区和actin基因的Miseq测序测序结果，进行硅藻和甲藻模拟群落的物种丰度和多样性分析，并建立基因序列与生物量之间的关系。得到的结果如下: 利用设计的通用引物将18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL基因在分离的37株硅藻中均获得了扩增和测序，测得的序列Blast结果显示，rbcL基因的正确率最高(88.9％)，18S次之，而COI的错误率最高(25％)。遗传差异和构建的贝叶斯树显示，18S rDNA的遗传变异度比较适中，可以在较高的分类水平上对硅藻进行聚类，也可以对直链藻属、楔形藻属、骨条藻属和双肋藻科等较低分类单位进行聚类分析。ITS和COI基因在硅藻门内遗传变异的程度很大，不再适用于较高分类单位的聚类分析，但是ITS适合用于海链藻目物种的DNA条形码鉴定和系统发育分析，而COI则更适合于羽纹硅藻的一些属的物种聚类分析和DNA条形码鉴定。rbcL基因相对18S更加保守，但是并不能在高分类阶元上进行硅藻的聚类分析，却可以聚类异极藻属、骨条藻属、冠盘藻科和根管藻科等个别较低分类单位的物种序列。 利用rDNA扩增子测序进行微藻群落中物种丰度的分析结果，以DNA为模板比以藻液为模板所构建的克隆文库检测到的物种多，但都只检测出少量物种并存在相同的物种扩增偏好性，且两个文库检测到的物种的比例与样本的细胞比例差异很大，一方面说明rDNA在不同硅藻物种中的拷贝数存在很大差异，另一方面说明rDNA构建克隆文库评估硅藻群落甚至真核微生物的组成结构存在很大误差。同时还检测到在不同的硅藻培养物内都存在ITS序列变异，但是变异程度很小(p＜0.013)。 对拷贝数较少的核编码的蛋白基因HSP90、elf2和actin基因设计通用引物并在8株甲藻中进行扩增和聚类分析，结果显示actin基因在扩增率、序列可利用率和物种的区分能力上均显示了一定的优势，基本上可以将甲藻在属水平进行区分和聚类。甲藻混合样本的actin基因克隆文库的构建和分析结果显示，actin基因能够将8个物种全部检出，序列与细胞的比例尚存在误差，但在属水平的误差要小于种水平的误差，物种检出率高于rDNA，丰度偏差低于rDNA。 采用Miseq测序对7个模拟的硅藻和甲藻混合样本分别进行了18S v9区和actin基因的测序分析结果显示，rDNA扩增子测序进行微藻群落结构分析的误差很大，用18S rDNA扩增微藻群落容易受真菌等的影响;而actin基因的引物对甲藻的扩增具有特异性，actin可在属水平上更接近地反应群落实际的物种丰度，且能够而更为准确的反应样本间的聚类关系。故本文认为actin基因作为环境生态系统中真核微生物群落结构分析的分子标记，比rDNA更具优势。
硅藻;脱氧核糖核酸;条形码基因;群落多样性
中国海洋大学
博士
生物化学与分子生物学
隋正红
2015
中文
Q949.271
122
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）