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    第一章 文献综述和立项依据
    第一节 降钙素的研究概况
    1 降钙素的来源
    2 降钙素的生物特性
    3 hsCT分子的概况
    4 降钙素的研究展望
    第二节 酿酒酵母rDNA的结构及其介导整合影响因素的研究进展
    1 酿酒酵母同源重组研究概况
    2 rDNA作为酿酒酵母同源重组位点的研究
    3 酿酒酵母rDNA序列元件组成及功能
    4 影响酿酒酵母rDNA的因素
    5 展望
    第三节 转基因食品的安全性评价研究
    1 转基因食品的概况
    2 转基因食品的安全问题
    3 转基因食品的安全性评价
    4 食品安全性评价的应用
    第四节 立项依据
    1 5hsCT基因的构建及表达研究
    2 以rDNA介导降钙素基因在酿酒酵母中的表达
    3 人／鲑嵌合降钙素串联基因在酿酒酵母中表达
    第二章 转5hsCT基因酿酒酵母的检测分析
    第一节 5hsCT基因向酿酒酵母的转化和检测
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第二节 人／鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达的定性和定量分析
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第三节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的降血钙活性研究
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第三章 5hsCT在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的优化
    第一节 不同条件对5hsCT基因在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达的影响
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果与分析
    5 讨论
    第二节 单因子实验对转基因酿酒酵母YS-5hsCT培养条件的优化
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果与分析
    5 讨论
    第三节 正交实验设计对5hsCT在酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的综合优化
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果与分析
    5 讨论
    第四章 小鼠口服转基因酿酒酵母YS-5hsCT的安全性评价
    第一节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT经口急性毒性实验
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第二节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致突变作用研究Ⅰ
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第三节 转基因酿酒酵母的致突变作用研究Ⅱ
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第四节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT的致畸变作用研究
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    第五节 转基因酿酒酵母YS-5hsCT对小鼠的30天喂养实验研究
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    6 小结
    总结
    参考文献
    致谢
    个人简历
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多拷贝人/鲑嵌合降钙素在酿酒酵母中表达优化及安全性评价研究

孙恒一
中国海洋大学
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引用
降钙素(Calcitonin，CT)是由32个氨基酸残基组成的多肽类激素，在体内的主要作用是通过抑制破骨细胞活性，减少骨质吸收，促进钙在骨中的沉积，从而降低血钙浓度，被广泛的使用于治疗Paget综合症，骨质疏松和高钙血症。研究表明，冻干的酵母作为多肽类药物载体可以抵抗蛋白酶降解能力，降钙素能够以多肽的形式直接穿过动物胃肠道的表皮细胞进入血液。因此，本实验室的孙平楠和姜勇等人前期分别构建了两个不同的转鲑鱼降钙素基因酵母yAGA2-sCT和yAGA2-r-sCT，均成功实现了鲑鱼降钙素的口服给药。为了进一步提高降钙素的表达量和生物活性，本研究将5拷贝人/鲑嵌合降钙素基因(5hsCT)，以rDNA作为同源重组位点多拷贝整合到酿酒酵母基因组中，并对其的表达条件和培养条件进行了优化，通过动物毒理学实验对其进行了安全性评价，为实现口服降钙素药物生产应用提供实验基础。　　本研究通过HpaI酶切表达载体pUC18-rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1获得线性rDNA2-ura3-Ppgk-5hsCT-rDNA1片段，以rDNA为同源重组位点将ura3标记基因和带有磷酸甘油酸激酶启动子(PGK promoter)的五拷贝人-鲑嵌合降钙素基因(5hsCT)引入到尿嘧啶缺陷型酿酒酵母菌株YS-△ura中，得到酵母重组菌株YS-5hsCT。Southern blotting显示5拷贝人-鲑嵌合降钙素基因(5hsCT)成功整合到酿酒酵母的基因组中，整合拷贝数为多拷贝。Western blotting结果表明，人/鲑嵌合降钙素在重组菌株YS-5hsCT中表达，经ELISA检测其表达量占酵母总蛋白的2.05％。通过转基因酿酒酵母YS-5hsCT的降血钙活性实验，发现经口灌胃0.01 g/kg转基因酿酒酵母的小鼠，其血钙值比正常小鼠的血钙值下降了0.498 mM，证明了具有体内生物活性。　　通过人/鲑嵌合降钙素基因5hsCT转录水平和表达水平分析优化了转基因酿酒酵母YS-5hsCT表达条件;并研究了单一外界因子对转基因酿酒酵母YS-5hsCT生长的影响;最后通过正交实验设计因子对5hsCT蛋白在转基因酿酒酵母YS-5hsCT中表达条件的综合优化，结果表明:(1)5hsCT基因表达的最优时间为96 h，最优温度为30℃，最优转速为225 rpm。(2)单一外界因子实验得出适宜转基因酿酒酵母YS-5hsCT生长的条件为:初始接种量为8％，培养时间为72 h，培养温度为30℃，搅拌转速为200～250rpm，通气量为7.0～8.5 l/min。(3)通过正交实验对5hsCT蛋白在转基因酿酒酵母YS-5hsCT表达的培养条件进行综合优化，得出最优化组合为:初始接种量为8％，培养时间为72 h，培养温度为30℃，搅拌转速为225rpm，通气量为7.0 l/min。在最优化组合条件下，在酿酒酵母细胞内5hsCT蛋白占总蛋白的2.08％，酿酒酵母YS-5hsCT-3的生物量为7.51 g/l·d，推算出5hsCT蛋白产量为156.21mg/l·d。　　对表达人/鲑嵌合降钙素的转基因酿酒酵母YS-5hsCT进行了毒理学实验，包括急性毒性实验、遗传毒性实验（小鼠骨髓微核实验和小鼠精子畸形实验）、传统致畸实验和30天喂养实验。经口急性毒性实验显示LD50≧10.0 g/kg，表明转基因酿酒酵母YS-5hsCT属于实际无毒物质;遗传毒性实验结果显示小鼠红细胞微核率和精子畸形率与溶剂对照组相比，没有显著差异且无剂量-效应关系，表明转基因酿酒酵母YS-5hsCT不具有遗传毒性，没有致突变作用;传统致畸实验结果显示灌胃转基因酵母YS-5hsCT的孕鼠生长发育良好，对所产小鼠胚胎外观和胎鼠内脏和骨骼观察无致畸现象，表明转基因酵母没有对孕鼠产生母体毒性，对母鼠的生殖机能没有不良影响，对小鼠胚胎发育无致畸作用;30天喂养实验中小鼠增重、血液和血液生化指标、脏器系数均在正常范围内，与对照组均无显著差异(P＞0.05)，脏器组织切片检查未发现病理性变化。因此转基因酵母YS-5hsCT未对小鼠无影响，是安全无毒的。　　本研究首次获得了无抗生素标记的重组降钙素酿酒酵母菌株，该菌株携带了多拷贝人鲑嵌合降钙素基因，而且在传代中保持稳定。通过优化培养和表达条件及进行安全性评价，为口服重组降钙素的工业化生产提供基础。

降钙素药物;安全性评价;动物毒理学实验;酿酒酵母

中国海洋大学

博士

生物化学与分子生物学

隋正红;臧晓南

2015

中文

R977.1

211

2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）