富油微藻筛选及球等鞭金藻(Isochrysis galbana)脂肪酸去饱和酶基因的克隆与功能研究
多不饱和脂肪酸(PUFAs)具有多种重要的生理活性功能，其中亚油酸(LA)、花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)均为人体必需的多不饱和脂肪酸。目前，PUFAs主要来源于海洋鱼类，其来源十分贫乏，远远不能满足市场需求，因此，寻找更为持续、稳定的PUFAs来源成为当务之急。海洋微藻是PUFAs的初级生产者，从微藻中提取的PUFAs无鱼腥味且胆固醇含量低。本论文以通过富油微藻筛选获得的球等鞭金藻（Isochrysis galbana）做为实验材料，该藻株属于自养单细胞微藻，总脂含量高达44.57％，其中不饱和脂肪酸含量丰富，占到总脂含量的50％以上，是研究脂肪酸合成途径中相关脂肪酸去饱和酶的良好材料。球等鞭金藻中具有多种脂肪酸去饱和酶(FAD)，并且能在藻体内表达产生PUFAs，通过对其FAD的种类、结构、功能以及代谢途径中的生理作用的研究，将有利于了解海洋微藻中的脂肪酸代谢途径，优化FAD在分子水平上的活性调控作用和底物特异性，为FAD在生物体内的遗传操作提供理论基础，实现PUFAs的高效表达。本文的工作内容和研究成果如下: 1、从藻种库中筛选获得18株总脂含量超过10％的微藻藻株，并对其进行了总脂和脂肪酸组成与含量的测定，其中包括3株金藻门藻株，3株甲藻门藻株，5株绿藻门藻株和7株硅藻门藻株。18株海洋微藻的总脂含量存在着显著差异，球等鞭金藻（Igalbana）的总脂含量最高，占干重的44.57±0.54％，其次为异弯藻(Heterosigma sp.)35.2±0.86％和湛江叉鞭金藻（Isochrysiszhanjiangensis）29.72±0.77％。 2、研究了不同培养温度、盐度、N浓度和P浓度对球等鞭金藻生长和脂肪酸组成与含量的影响。研究结果表明，球等鞭金藻具有较强的环境耐受性，在温度(15-30℃)，盐度(15-60‰)，N浓度(0-1760μmol/L)，P浓度(0-72.6μmol/L)范围内均可生长。最适生长条件为温度(20-25℃)，盐度30‰，N浓度(440-880μmol/L)，P浓度（18.15-36.3μmol/L）。总脂含量与不饱和脂肪酸的组成和含量随环境因子的变化具有显著差异。研究结果发现，较高温度和营养盐丰富(N、P)条件下有利于球等鞭金藻的生长，低温、高盐和N限制则有利于藻体内总脂和不饱和脂肪酸含量的积累。通过气相色谱质谱分析不同培养条件下球等鞭金藻的脂肪酸组成，发现藻体中不饱和脂肪酸种类多样，含有多种单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，是克隆去饱和酶基因家族的良好实验材料。 3、通过对球等鞭金藻进行转录组测序，获得多条脂肪酸去饱和酶的基因片段，利用SMART RACE技术成功克隆了球等鞭金藻的Δ5和Δ12脂肪酸去饱和酶基因全长序列。Δ5脂肪酸去饱和酶基因（IgFAD5），其开放阅读框(ORF)全长1，320 bp，编码440个氨基酸，等电点为9.07，相对分子质量为49.74 kDa，提交GenBank获得accession no.AFD22890，蛋白序列分析表明，其N端存在一个保守区域(motif)-HPGG，是类细胞色素b5结构域，并且其还含有3个高度保守的组氨酸簇(HX3H，HX2HH和QX2HH)分别为HEGGH、HNKHH和QIEHH，第三个组氨酸簇的第一个H被Q取代;Δ12脂肪酸去饱和酶基因（IgFAD12），其开放阅读框（ORF）全长1，158bp，编码386个氨基酸，等电点为9.20，相对分子质量为42.80 kDa，提交GenBank获得accession no.AFB82638，蛋白序列分析表明，同样含有3个高度保守的组氨酸簇（HX3H，HX2HH和HX2HH）分别为HECGH、HAKHH和HVVHH。IgFAD5和IgFAD12两蛋白二级结构中均由α螺旋、β折叠片和无规则卷曲3种结构组成，并具有4个明显的跨膜α螺旋区，从而进一步表明这两个基因属于脂肪酸去饱和酶家族。 4、利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术研究了在非生物胁迫条件（温度、盐度、N浓度）下，上述2个脂肪酸去饱和酶基因(IgFAD5和IgFAD12)的差异表达情况。IgFAD5基因仅在低温(15℃)处理6-12h期间表达水平较高，IgFAD12基因在低温(15℃)条件下则始终高于对照组的表达水平。在高盐(62‰和93‰)条件下，IgFAD5和IgFAD12的基因表达水平与对照组相比均有所升高。IgFAD5和IgFAD12基因在不同N浓度条件下均表现为上调表达，N限制（220μmol/L）条件下，两基因的表达水平更高。研究结果表明，在不同非生物胁迫条件（温度、盐度、N浓度）下，IgFAD5和IgFAD12的表达存在显著差异。 5、对IgFAD5和gFAD12基因构建表达载体，转入酿酒酵母中进行表达，进行相关基因的功能验证。气相色谱质谱分析结果表明，IgFAD5转基因酵母的脂肪酸组分中分别有2个新的与C20∶4和C20∶5标样出峰时间一致的色谱峰，IgFAD12转基因酵母的脂肪酸组分中有1个新的与C18∶2标样出峰时间一致的色谱峰，而对照组酵母中没有，说明IgFAD5和IgFAD12基因在酵母中得到了正确表达。本研究结果表明，IgFAD5基因具有催化相应底物的脂肪酸去饱和酶功能，Ig FAD12基因可将C18∶1转化为C18∶2，推测克隆得到的IgFAD12基因应该属于内质网上的Δ12脂肪酸去饱和酶基因。本研究为明确球等鞭金藻的脂肪酸代谢途径提供了依据。
球等鞭金藻;脂肪酸去饱和酶基因;基因克隆;生理功能;富油微藻
中国海洋大学
博士
生物化学与分子生物学
刘晨光
2015
中文
Q949.26
116
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）