三角褐指藻(Phaedoactylum tricornutum Bohlin)减数分裂相关基因的系统学分析、表达检测及功能验证
有性生殖是真核生物特有的繁殖方式，减数分裂则是有性生殖的标志性事件。真核生物在地球上分布广泛且适应地球复杂的生存环境，很大程度上依赖于减数分裂前期Ⅰ同源染色体非姐妹染色单体间的遗传重组。对调控此过程的相关基因的系统学分析可作为判断有性生殖是否存在的重要依据。我们搜索了六大真核生物超群中5个超群的减数分裂相关基因，通过文献选择了24个相对保守的减数分裂关键基因。所选基因广泛存在于已测序或已知EST序列的真核生物，并作用于减数分裂同源重组过程。本研究通过文献选择下载各真核生物超群的模式生物减数分裂关键基因的蛋白质序列，利用贝叶斯建树法对这些基因所编码的蛋白质做了系统学分析，构建了系统演化拓扑树。 三角褐指藻是一种广泛分布于水体中的单细胞微藻，基因组测序工作已经完成。由于其含有丰富的多不饱和脂肪酸（PUFAs: polyunsaturated fatty acids）和三酰基甘油(TAGs:triacylglycerols)，并且具有其他特殊的生物学特性，成为近年来研究的热点。然而三角褐指藻是否进行有性生殖依然不为人知，这是良种培育和种质保持不能不面对的问题。我们通过同源搜索和系统学分析在三角褐指藻基因组检测出24个减数分裂关键基因的19个(Smc1，Smc2，Smc3，Smc4，Smc5，Hop1，Rad21，Spo11，Rad51，Rad50，Mnd1，Pms1,Mre11,Mlh1，Mlh3，Msh2，Msh4,Msh5 and Mer3)，其中包括6个减数分裂特异基因（粗体）。这些基因编码的产物蛋白质涉及姐妹染色单体的粘连，同源染色体配对调控，联会复合体的形成，同源染色体非姐妹染色单体的同源重组等多种功能。 虽然三角褐指藻中存在减数分裂相关的同源基因，但这些基因是否表达，是否具有相应的功能，通过系统学分析仍然不能得到确切的答案，因此我们在转录组水平上对部分减数分裂关键基因(MND1，MSH4，MSH5，MER3，MRE11，MLH1)及两个减数分裂特异基因的五个同源基因片段（SPO11-1，SPO11-10，DMC1-2，DMC1-9，DMC1-22）进行检测，发现三角褐指藻中这些同源基因均有表达。即使这些基因都表达，但表达产物未必参与减数分裂过程，因此这些基因的功能验证实验必不可少。 SPO11特异调控减数分裂过程中DNA双链断裂点的形成，DMC1则只在减数分裂过程中促进同源染色体非姐妹染色单体间的交叉互换。我们从三角褐指藻基因组中成功克隆了与这两个基因相似性很高的四个同源基因SPO11-1，SPO11-10，DMC1-2和DMC1-9，并将这些基因转入相应基因的酵母缺陷型菌株，用以验证这些基因是否具有相应减数分裂功能。实验结果表明，SPO11-10具有补救酵母缺陷菌株减数分裂的功能，能够使酵母转化株恢复正常野生型酵母的产孢率，而DMC1同源基因不能使酵母dmc1缺陷型菌株恢复正常野生型酵母产孢率。这四个减数分裂同源基因的功能验证实验结果与这些基因的生物信息学分析结果一致。 在目前被公认的无性繁殖生物体内仍然可以检测出与减数分裂特异基因同源的基因，这一结果表明，无性繁殖生物群体很可能是由有性繁殖的祖先“退化”而来，或者该群体具有隐性有性生殖。系统学分析发现三角褐指藻具有9个减数分裂特异基因中的6个，且功能验证实验证实SPO11-10仍然具有相应减数分裂功能，因此，即使三角褐指藻现在主要通过有丝分裂进行细胞增殖而未见减数分裂过程，但也可能具有有性生殖的能力。 本论文将四个海洋微藻中减数分裂特异基因的同源基因在酵母相应缺陷型菌株中进行表达，通过互补实验成功验证其功能，结合生物信息学分析以及相关关键基因的表达检测，为不易观察生活史类型的海洋单细胞微藻三角褐指藻生殖方式的判断提供了新的依据，也为没有建立完善遗传操作体系的海洋微藻基因功能研究提供了新的思路。
三角褐指藻;减数分裂;基因蛋白;系统学分析
中国海洋大学
博士
生物与分子生物学
杨官品
2015
中文
Q949.2
126
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）