海洋弧菌QY104的褐藻胶裂解酶AlyV4的研究
褐藻胶是褐藻细胞壁和一些细菌生物被膜的主要成分。它是一种线性的多聚糖，由两种糖单元β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)通过α或β-1，4糖苷键连接而成。褐藻胶一般有三种结构:由β-D-甘露糖醛酸组成的多聚甘露糖醛酸片段，即polyM;由α-L-古罗糖醛酸组成的多聚古罗糖醛酸片段，即polyG;由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古罗糖醛酸随机排列组成的MG交替片段。褐藻胶被广泛应用于许多工业领域，褐藻寡糖也被发现具有很多生物活性。 褐藻胶裂解酶通过β消去机制降解褐藻胶，产生非还原端不饱和的褐藻胶寡糖。褐藻胶裂解酶具有多种用途，如降解褐藻胶产生寡糖、治疗CF病人纤维化肺病、制备海藻原生质体等。 本文从海水、海泥和腐烂的海藻中分离到13株高产褐藻胶裂解酶的菌株。底物专一性实验结果显示，菌株QY104产生的褐藻胶裂解酶偏好降解polyG片段。通过对菌株QY104的16S rRNA序列分析，鉴定该菌属于弧菌属。 弧菌QY104的发酵上清经过硫酸铵沉淀、疏水作用层析和离子交换层析后，分离得到褐藻胶裂解酶AlyV4。SDS-PAGE电泳分析显示其分子量大小为33kDa。对褐藻胶裂解酶AlyV4性质研究后发现，其最适反应温度为45℃，最适反应pH为7.6，褐藻胶裂解酶在pH7.0-10.6以及45℃以下范围内稳定。氯化钠可以大幅度提高该酶的活性，并对其热稳定性具有重要影响。AlyV4的活性几乎被Cu2+、Fe3+和EDTA完全抑制，Fe2+、Al3+、Ba2+、Ni2+、Zn2+、Mn2+和SDS对其活性具有不同程度的抑制作用。对降解产物进行FACE电泳分析表明，褐藻胶裂解酶AlyV4降解polyG片段后产生二糖、三糖和四糖，降解褐藻胶后产生二糖、三糖、四糖和五糖。 根据褐藻胶裂解酶AlyV4的蛋白质序列信息，通过简并PCR和SiteFindingPCR克隆到该酶的编码基因alyV4。其包含1359 bp的开放阅读框，共编码452个氨基酸序列，理论分子量为50 kDa，理论等电点为4.6。序列分析显示褐藻胶裂解酶AlyV4属于多糖裂解酶第7家族（PL-7），和Saccharophagus sp.Myt-1编码的一个褐藻胶裂解酶同源性最高，达到63％。褐藻胶裂解酶基因alyV4编码的蛋白质包含信号肽序列、N末端碳水化合物结合序列和C末端褐藻胶裂解酶催化区，分离纯化到的褐藻胶裂解酶AlyV4只是其蛋白质序列中的催化区部分。 成功构建了三种重组表达载体，分别编码AlyV4的全序列(AlyV4-SNC)、AlyV4的去信号肽序列(AlyV4-NC)及AlyV4的催化区(AlyV4-C)。转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，在LB培养基中培养到OD600约0.5左右，加入终浓度1 mM的IPTG，25℃诱导20 h。离心收集菌体，超声破碎后，使用Ni亲和层析柱对重组蛋白进行了分离纯化。对酶学性质研究显示，重组酶AlyV4-C和从野生菌中分离纯化到的褐藻胶裂解酶AlyV4性质基本一致，但与重组酶AlyV4-C的性质具有一定的差异。重组酶AlyV4-NC在4℃存放2周会发生断裂。
褐藻胶裂解酶;海洋弧菌;蛋白质序列;基因编码
中国海洋大学
硕士
微生物与生化药学
于文功
2013
中文
Q557.9
132
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）