海洋芽孢杆菌B-9987中Macrolactins糖基化后修饰步骤的分子机制研究
海洋芽孢杆菌B-9987（Bacillus marinus）分离于我国渤海潮间带植物盐地碱蓬（Suaeda salsa）的根部，能够产生多种macrolactins化合物。Macrolactins是一系列24元大环内酯类化合物，主要分离自Actinomadura sp.和Bacillus sp.等海洋来源的微生物之中，具有广泛的抗菌、抗病毒和抗肿瘤等生物学活性。Macrolactins合成的最后阶段要经过一些后修饰步骤，如糖基化、酰基化等，这些后修饰步骤都发挥着重要的生物学功能。其中糖基化修饰能够增加化合物的水溶性，提高生物活性以及降低毒性，而负责糖基化的酶为糖基转移酶(Glycosyltransferases，GTs)。GTs将活化的各种糖基通过O-、C-、N-或S-键连接到天然产物前体上，形成各种具有活性的天然产物。本论文以海洋芽孢杆菌B-9987为研究对象，采用比较基因组学的方法，从B-9987中鉴定了macrolactinsGT基因，对其进行了克隆、异源表达和体外酶学实验，具体研究工作如下: 首先，对海洋芽孢杆菌B-9987的次级代谢产物进行了分离鉴定。运用正相硅胶柱层析、半制备HPLC等现代色谱技术，NMR、MS等现代波谱技术，从发酵物中分离鉴定了3个macrolactins化合物，经化合物的波谱学数据及与文献对照，这3个化合物的结构分别被鉴定为:macrolactin A、7-O-malonylmacrolactin A和macrolactin B。本研究以分离得到的macrolactins化合物作为糖基转移酶的底物，对macrolactins生物合成的糖基转移酶的基因进行功能鉴定，并进行下一步的酶学性质研究。 其次，采用比较基因组学的方法，从B-9987中定位了macrolactins GT基因bmmGT1。构建了bmmGT1重组表达质粒并将其导入E.coli BL21中，在16℃，0.2mM IPTG诱导条件下，实现了可溶性表达，纯化后初步检测了其催化活性。 再次，对分离纯化得到的糖基转移酶BmmGT1的酶学性质进行研究，主要包括影响酶活的pH、温度和金属离子。另外，本文还对BmmGT1的底物多样性进行了研究,包括糖基供体多样性、受体多样性以及催化糖基化逆反应的能力在探索了对两种糖基受体 macrolactinA和7-O-malonyl macrolactin A多样性的基础上，对BmmGT1催化这两种底物的动力学参数进行了比较，确定了酶的最适底物。 最后，本文通过糖基化反应分离得到了3种新颖的糖基化产物。通过对macrolactins糖基化反应能够提高大环内酯类化合物的水溶性，进而可能改善其生物利用率，增强药效，降低毒副作用，为大环内酯类化合物的药物研制提供了一个新的策略。
海洋芽孢杆菌;大环内酯类化合物;糖基化修饰;分子机制;药理活性
中国海洋大学
硕士
微生物与生化药学
李文利
2014
中文
R282.71;R284.1
101
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）