β-琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶AgWH117A结构的研究
琼胶酶是一类能够降解琼胶生成琼胶寡糖的酶。根据断裂方式的不同可分为α-琼胶酶和β-琼胶酶。琼胶酶的应用非常广泛:可作为工具酶分离海藻中的原生质体;回收琼脂糖凝胶中DNA和分析海藻细胞壁中多糖成分。另外琼胶酶降解琼脂产生的琼胶寡糖由于其显著的生物学活性，在食品和医药领域也有广泛的应用。本文从青岛近海的红藻中筛选得到一株高产琼胶酶菌株，并通过发酵优化之后，分离纯化得到2种功能良好的β-琼胶酶;同时对本课题组表达成功的新琼二糖水解酶AgWH117A进行了结晶以及结构解析。主要研究内容及结论如下: (1)从青岛近海红藻类以及印尼海泥中筛选得到了6株海洋产琼胶酶菌株。经过16S rRNA测序鉴定，确定其分别属于Pseudoalteromonas sp.、Agarivoransalbus.、Vibrio lentus和Microbulbifer sp.，并对其中产琼胶酶活性高的菌株进行了菌株鉴定其为Agarivorans albus，并命名其为Agarivorans albus OAY2。为提高OAY2菌株的产酶量，对发酵培养基进行了优化。确定其最佳优化条件为蛋白胨0.49 g/L，酵母粉1.08 g/L，pH9.85。酶活由原来的1.06 U/mL提高到2.65 U/mL。 (2)从Agarivorans albus OAY2发酵液中，纯化得到了2个β-琼胶酶，分别命名为琼胶酶a和琼胶酶b。发酵液经硫酸铵分级沉淀，硫酸铵饱和度为60％时，酶获得最佳比活。优化蛋白纯化条件，发现琼胶酶a在20 mM，pH6.0的磷酸盐缓冲液中经DEAE柱子可以得到纯度较高的蛋白;琼胶酶b在20 mM，pH7.0的Tris-Hcl缓冲液中经强阴离子交换柱Q柱，可以达到纯度较高的蛋白。琼胶酶a和b纯化之后的回收率分别为0.16％和0.09％，比活由原来的25.26 U/mg分别提高到了2715 U/mg和1338 U/mg。 琼胶酶a，b的分子量分别为50 kDa和107 kDa。琼胶酶a的最适温度与pH分别为40℃和9.0，琼胶酶b的最合温度与pH为50℃和9.0。Cu2+，Co2+，Mn2+对琼胶酶a，b有很大的抑制作用，而DTT对这两个酶有很大的促进作用。13C-NMR和TLC结果显示琼胶酶a的主要产物是新琼二糖(NA2)，新琼四糖(NA4)和新琼六糖(NA6)。琼胶酶b的只要产物是八糖以上的糖，但是它也可长时间反应生成NA2。根据基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)结果显示，琼胶酶a属于糖苷水解酶(GH)118家族，琼胶酶b属于GH50家族。 (3)新琼二糖水解酶AgWH117A能够降解新琼寡糖生成琼寡糖和内醚半乳糖，是微生物代谢琼脂的关键酶之一，也是生产奇数琼寡糖和内醚半乳糖的重要工具酶。 经过X-射线衍射得到新琼二糖水解酶AgWH117A的三维结构。对比NCBI数据库中有结晶的蛋白质氨基酸序列为α-NABH(Saccharophagus Degradans2-40)其相似性最高的为74％。活性位点关键氨基酸其同为广义碱Asp52-Asp207和广义酸Glu207。在AgWH117A的三维结构中，一个不对称单元有两个分子，空间位置是p21位，推测其催化机制是保留机制。 利用“TK-SA”模型探索影响AgWH117A酶活热稳定性氨基酸位点。“TK-SA”模型是以氨基酸之间的相互作用力为依据，计算出分子间斥力，排除斥力较大的氨基酸，活性位点的氨基酸以及loop环上的氨基酸。通过11个位点的丙氨酸扫描之后，发现能够提高AgWH117A酶活热稳定性的突变体。 (4)本研究纯化得到的琼胶酶a，b在较广泛的温度与pH范围内具有很高的活性。较好的热稳定性及pH稳定性增加了其在工业当中的应用。酶a与酶b的产物丰富，包括NA2、NA4、NA6、NA8等糖。不仅这两个酶，这个菌株Agarivorans albus OAY02也值得我们进一步研究。 通过蛋白质结晶获得了在琼胶酶降解菌中关键酶之一，AgWH117A的晶体结构。晶体结构的获得，能够更好的阐述其作用机制，并为改造酶提供更加科学的依据。
β-琼胶酶;菌株筛选;新琼二糖水解酶;蛋白结构
中国海洋大学
硕士
水产品加工及贮藏工程
毛相朝
2015
中文
Q556
83
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）