磷酸化南极磷虾肽增加骨质疏松症大鼠的骨密度及其作用机制研究
骨质疏松症是一种以骨量降低，骨微结构破坏，导致骨脆性和骨折发生率增高的全身性骨病。绝经后骨质疏松症是骨质疏松症中最为常见的类型，它的显著特征表现为高骨转换型，即骨吸收与骨生成均处于活跃状态。目前全世界2亿多骨质疏松症患者中约有33％为绝经后妇女，而治疗骨质疏松症的药物副作用较大，因此需要寻找安全有效的抗骨质疏松活性物质。南极磷虾含有丰富的优质蛋白，蛋白质磷酸化是提高蛋白质功能的一种有效手段，磷酸基的导入会促进生物体对钙的吸收，但对于磷酸化蛋白改善骨质疏松的研究尚无报道。从南极磷虾蛋白中制备的南极磷虾肽具有多种生物活性，但关于磷酸化南极磷虾肽（phosphorylated peptides from Antarctic krill，PP-AKP）在抗骨质疏松活性方面的研究未见报道。因此，本论文采用双侧去卵巢手术建立骨质疏松症大鼠模型，系统研究了PP-AKP对骨质疏松症的改善作用，并阐明了其可能的作用机制，主要研究结果如下: 从南极磷虾中制备的PP-AKP，其分子量范围为200-2000Da，蛋白含量为90.71％，磷含量为1.52％，氟含量为2.49ppm（符合食品安全国家标准）。模型大鼠灌胃PP-AKP90d后，其血液、尿液生化指标结果显示，PP-AKP能显著降低模型大鼠血清中BALP活性和OCN、PICP含量，增加OPG含量，降低RANKL含量，降低RANKL/OPG比值，调控模型大鼠骨生成，抑制高骨转换速率，抑制骨吸收;PP-AKP能显著降低血清中TRACP、Cath-K活性和CTX-1含量，降低尿液中DPD、Ca、P含量，抑制模型大鼠骨吸收，抑制胶原和矿物质的丢失。炎症因子能通过诱导破骨细胞前体细胞分化成破骨细胞，介导骨吸收。实验结果显示，PP-AKP能显著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO含量和COX-2活性，抑制模型大鼠骨吸收。提示PP-AKP能显著抑制模型大鼠的高骨转换状态，抑制骨吸收。 骨密度是诊断骨质疏松症的金指标。骨生物力学是全面评价骨质量，预测骨折发生的关键指标。实验结果显示，PP-AKP能显著增加模型大鼠股骨和胫骨骨密度，增加模型大鼠胫骨最大载荷和结构强度，提高生物力学性能。股骨组织学分析进一步显示，PP-AKP能显著增加骨小梁数目，增加骨小梁面积，降低骨小梁间距，修复骨组织网状结构，维持较高的骨连接。提示PP-AKP能提高模型大鼠的骨强度，减少骨折发生。 成骨细胞在骨质疏松中起关键作用，它不仅介导骨生成，而且调控破骨细胞介导的骨吸收。其中经典的Wnt/β-catenin信号通路是成骨细胞介导骨生成的主要通路。qRT-PCR结果显示，PP-AKP能显著下调模型大鼠股骨Wnt/β-catenin信号通路中关键基因LRP-5b、β-catenin、RUNX2、OSX mRNA的表达，显著下调COLⅠ、OCN、ALP等成骨细胞功能相关基因mRNA的表达。Western blot结果显示，pP-AKP能显著抑制模型大鼠股骨LRP-5b、总β-catenin、核β-catenin、RUNX2等蛋白的表达。提示PP-AKP通过下调Wnt/β-catenin信号通路，调控模型大鼠的骨生成，抑制模型大鼠高骨转换状态。 OPG/RANKL/RANK通路在成骨细胞调控破骨细胞活性和功能方面起重要作用。NF-κB和MAPKs信号通路的激活是OPG/RANKL/RANK信号通路传递的特征标志。qRT-PCR结果显示，PP-AKP能显著上调模型大鼠股骨OPG mRNA的表达，显著下调RANKL mRNA的表达，对RANK mRNA的表达无显著影响;显著下调NF-κB通路中关键基因TRAF6、NF-κB、c-fos和NFATC1 mRNA的表达。Western blot结果显示，PP-AKP能显著上调模型大鼠股骨OPG的蛋白表达，显著下调RANKL、TRAF6、NFATC1的蛋白表达，显著下调p-NF-κB的蛋白表达水平，但对NF-κB总蛋白的表达无显著影响。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/NF-κB信号通路的激活。另外，PP-AKP显著下调MAPKs通路中p38、ERK、JNK等mRNA的表达，显著下调p-p38的蛋白表达，但对p38总蛋白的表达无显著影响。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/MAPKs信号通路的激活。Cath-K、MMP-9和TRACP是破骨细胞吸收功能的标志性指标。结果显示，PP-AKP能显著抑制Cath-K、MMP-9和TRACP mRNA的表达，显著抑制Cath-K和MMP-9蛋白的表达。综上结果显示，PP-AKP能通过抑制OPG/RANKL/NF-κB和OPG/RANKL/MAPKs信号通路的激活，抑制破骨细胞的分化成熟，抑制模型大鼠的骨吸收。 本论文首次证明了PP-AKP增加骨质疏松症大鼠骨密度的作用，并对其作用机制进行了深入阐明，为南极磷虾的高值化利用和新型抗骨质疏松症相关的营养品、功能食品、药物等的开发提供了科学依据。
骨质疏松症;磷酸化南极磷虾肽;骨密度;临床观察
中国海洋大学
硕士
水产品加工及贮藏工程
王静凤
2015
中文
R681;R282.74
92
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）