羰基化对刀额新对虾原肌球蛋白结构的影响及修饰位点的鉴定
随着现代社会不断的发展，人类的饮食结构发生了巨大的改变，与食物直接相关的过敏疾病发病率也在逐年增高，给人们的生命健康造成了巨大威胁。虾类产品属于我国产值比较高的甲壳类海产品，由于营养丰富、味道鲜美，深受消费者的喜爱。然而随着虾类水产品越来越广泛的应用到食品工业中，使许多消费者饱受过敏症状的困扰。本论文着重对刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的结构进行全面研究。探讨羰基化对其结构变化及修饰位点的影响，从机理角度进行深入的解析，为过敏原性质的改变提供理论指导。主要内容如下: 1、为了探究虾类在贮藏过程中过敏原结构的变化情况，本文以刀额新对虾为研究对象，采用不饱和脂肪酸的过氧化产物---丙二醛(MDA)对虾过敏原（原肌球蛋白）进行氧化，检测结构变化的规律。结果显示原肌球蛋白经过氧化后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到原肌球蛋白发生交联出现2、3、4、5倍的分子重量的4新条带。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为86.14℃，氧化后原肌球蛋白热稳定性变化不大。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低13.5％，有新的化学键形成，氧化后伴随着二，三级结构的破坏。红外光谱检测到在3010.06cm-1处有吸收峰表明有烯烃的存在，说明MDA能与氧化原肌球蛋白中的某些氨基酸的活性侧链相结合，形成新的羰基以及使其他功能发生过改变。虾原肌球蛋白由284个氨基酸组成，LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到4个赖氨酸（76，168，189和233）、5个谷酰胺(61，70，118，147和247)、4个天冬酰胺（17，107，203和215）被氧化修饰。在数据库检测中发现部分氨基酸易被丙二醛氧化修饰外，其中蛋氨酸易被活性氧氧化，使原肌球蛋白的结构发生变化。 2、不饱和脂肪酸的另一种过氧化产物—4-羟基壬烯醛(HNE)对虾原肌球蛋白进行氧化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察到原肌球蛋白氧化前后基本呈现相似的条带，说明HNE氧化修饰后原肌球蛋白不发生交联，可能的原因是HNE包含一个活性醛基，而之前提到的MDA发生交联可能原因是MDA含有两个活性醛基。氧化吸收后原肌球蛋白的紫外吸收强度增加，发生轻微的蓝移，肽键可能被破坏使一级结构发生变化。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为59.99℃，热稳定性发生明显的改变，氧化后的原肌球蛋白发生明显的变性，构象型结构发生改变。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低2.5％，原肌球蛋白范德华力被破坏，伴随着二，三级结构的改变。氧化前后进行核磁分析，氨基化合物和甲基均发生了变化。通过LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到5个丙氨酸（36，77，81，86和242）、9个亮氨酸(53，57，78，88，94，95，99，113和169)、3个赖氨酸（38，48和66）和1个组氨酸(44)被氧化修饰。相同地，在数据库检测中发现部分氨基酸易被HNE氧化修饰外，其中蛋氨酸易被活性氧氧化，氧化会使原肌球蛋白的结构发生变化。 3、虾类加工过程能够对虾类的过敏原结构和性质产生影响，从而改变其致敏活性。本实验选取核糖与虾过敏原进行糖基化反应。SDS-PAGE结果表明美拉德反应使虾过敏原分子量增高。原肌球蛋白氧化前的峰值为88.80℃，氧化后的峰值为35.71℃，热稳定性也发生明显的改变。圆二色谱检测到α-螺旋的含量降低1.4％，核糖与原肌球蛋白结合范德华力被破坏，伴随着二，三级结构的改变。通过LC-MS-MS对氨基酸的氧化位点进行鉴定，检测到1个苯丙氨酸(278)、3个异亮氨酸（69，92和190）、5个核糖修饰的蛋氨酸（11，50，126，141和171）和5个活性氧修饰的蛋氨酸（19，50，126，141和171）被氧化修饰。在数据库检测中发现部分氨基酸易被核糖氧化修饰，其中蛋氨酸也易被活性氧修饰，氧化会使原肌球蛋白的结构发生变化。 实验结果表明，羰基化修饰能诱导过敏原蛋白质的结构变化，对氨基酸位点修饰。蛋白质构象的变化以及位点的修饰，如暴露或掩埋进分子内部的氨基酸，均可以解释过敏原抗原性改变的原因。这些研究有助于对虾类过敏原的认识和控制，对于开发和生产低过敏性或无过敏性水产类食品，保障消费者食用安全等具有积极的意义。
刀额新对虾;原肌球蛋白;羰基化水平;结构变化;修饰位点
中国海洋大学
硕士
食品工程
林洪
2015
中文
Q959.223.63
64
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）