海雪颗粒和其附着细菌的密度感应及其调控细菌胞外水解酶分泌的研究
密度感应(quorum sensing，QS)是细菌通过信号分子的积累感知细菌的数量（细胞密度），从而调控细菌共生、毒性、抗生素的产生、生物发光和生物膜形成等多种行为相关基因表达的一种调控机制。在众多QS信号分子中，N-酰基高丝氨酸内酯类(N-acyl homoserine lactones，AHLs)化合物是最重要的一类，是调控革兰氏阴性菌生物功能的主要信号分子。海洋是全球物质循环特别是碳循环的巨大的库，在缓解全球变暖中起到重要作用。海洋中海雪颗粒的沉降是碳从海洋表面运输到海底的重要过程。细菌的拮抗能力和胞外水解酶活性是使它们在海雪中生长优越的先决条件，海雪中往往含有比周围海水更高的细菌丰度，而这部分细菌被认为具有QS系统。一般认为，海雪是由肉眼可见的有机和无机碎屑聚集物以及浮游植物、浮游动物和细菌等生物体所组成的大颗粒物质，在物质从海表面到深海的垂直运输过程中起到重要的作用。海雪颗粒的降解主要由具有QS的细菌所介导，是碳从大气到深海运输中的重要调控过程。本论文鉴定了自然海雪颗粒和其附着细菌中的AHLs分子，同时探讨了外源信号分子和QS淬灭酶AiiA对细菌胞外水解酶产生的影响。 海雪样品收集自渤海N5、黄海A7和E1三个不同站位的表层海水。本研究使用Agrobacterium tumefaciens A136和Chromobacterium violaceum CV026两种报告菌株，通过琼脂平板法，直接检测海雪样品中的AHL分子。从海雪中分离了53株细菌并进行16S rRNA基因分析鉴定，筛选具有产AHL能力的菌株。使用0.5％甲酸酸化的乙酸乙酯提取海雪样品和分离菌株的AHL，并通过反向薄层色谱和气相色谱-质谱分析法对提取的AHL进行鉴定。此外，通过酶琼脂平板法对菌株8种胞外水解酶的产生能力进行筛选，检测的水解酶包括明胶酶，纤维素酶，碱性磷酸酶，褐藻胶裂解酶，几丁质酶，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，并用分光光度法检测六种外源AHL（C4-HSL，3OC6-HSL，C6-HSL，C8-HSL，C10-HSL和C12-HSL）和密度感应淬灭酶AiiA的添加对细菌胞外水解酶产生的影响。 本研究首次从采自中国边缘海的海雪颗粒中检测到了AHL的存在，通过反向薄层层析(phase-thin layer chromatography，RP-TLC)和气象色谱一质谱分析法鉴定了两种AHL分子:3OC6-HSL和C8-HSL。另外，在从海雪颗粒分离得到的53株菌株中，10株（占19％）能产生AHL信号分子。通过16S rRNA基因测序鉴定，这些与QS相关的菌株大部分与Aeromonas属相近，其他菌株与γ-变形菌纲的Citrobacter，Pantoea，Shigella，Pseudoalteromonas和Alteromonas属相近，只有一株细菌属于α-变形菌纲的Paracoccus属。 本论文首次发现海雪细菌P.ananatis B9可以产生6种不同的AHL分子，即C4-HSL，3OC6-HSL，C6-HSL，C10-HSL，C12-HSL和C14-HSL;第一次发现了AHL调控的QS系统与P.ananatis B9胞外水解碱性磷酸酶，Aeromonasbestiarum A10明胶酶和Citrobacter freundii B1纤维素酶（外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶）的产生有关。 总之，本论文直接从海雪样品中检测到了AHL分子的存在并从海雪中分离了53株细菌，其中10株可以产AHL分子。通过研究外源AHL分子对胞外水解酶分泌的影响，发现外源AHL分子可以明显加强P.ananatis B9的碱性磷酸酶、A.bestiarum A10的明胶酶和C.freundii B1的纤维素酶的产生;相比之下，QS淬灭酶AiiA明显降低了上述酶的产生。这些研究结果表明，AHL类的QS系统可能调控海雪的降解，在海洋食物网和生物地球化学循环中起到重要作用。
海雪;附着细菌;密度感应;N-酰基高丝氨酸内酯;胞外水解酶
中国海洋大学
博士
微生物学
张晓华
2015
中文
Q939.1
130
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）