墨西哥钝口螈趾部再生过程中基质金属蛋白酶基因MMP3/10a、MMP3/10b和MMP9的鉴定、表达模式和功能分析
近年来对于再生过程的研究非常热门。蝾螈作为再生研究的模式生物有着不可代替的优势。蝾螈在进化上属于脊椎动物，再生能力却没有像其他脊椎动物退化严重，其趾可以同源到人类的手指。并且对于人类有限的指再生能力，使得蝾螈趾再生相对于附肢再生的研究更有应用前景。然而到目前为止，对于蝾螈趾部再生研究的报道甚少。本文首次开展了墨西哥钝口螈趾部切除再生的相关实验，包括研究再生过程形态组织学分析及基质金属蛋白酶(MMPs)的时空表达模式和功能等。 首先开展了趾部再生形态学观察，蝾螈的趾部再生周期为5-6周。HE染色组织学分析，将趾部再生分3个阶段。创伤愈合期，手术创伤几小时后伤口附近表皮细胞迁移形成单层伤口表皮(WE)覆盖住伤口;芽基形成期（创伤后3-10天），在增厚的WE（或称顶表皮帽，AEC）下方间质细胞聚集，进一步形成了锥体型结构的再生芽基;分化和形态发生期，14天时在芽基内部出现分化的软骨细胞，继而经过复杂的分化和形态发生过程，形成血管、骨骼等，组装成完整的趾。 其次通过原位杂交技术对再生过程中相关的MMPs家族重要基因进行时空表达模式探究。结果显示，3个基因主要在创伤愈合期和芽基期以特定形式表达。MMP3/10a基因在1天时表达最强，且在伤口边缘表达，随后逐渐覆盖整个伤口上皮，而后在7、14、21天表达转移到组织内部。MMP3/10b和MMP9基因表达除了稍微差异也表现了同样的特点。另外，本文还通过实时定量PCR技术探究了3个基因各再生阶段的相对表达量情况。与正常的趾相比，在再生的各阶段MMPs表达会波动性地大幅上调。以MMP9为例，在第1天的时候（伤口愈合期）其表达量最高，然后出现下降又上升趋势，在7天（20倍）和14天(16倍)分别形成一个小高峰，然后21天就下降到了正常组织表达量的2倍。 为检测再生时期MMPs的酶活性变化，我们运用酶谱法对趾再生各阶段进行实验。结果显示再生6小时，在80kDa和90kDa之间检测到微弱的分子量大小十分相近的两条条带，这与MMP9的潜伏形式和活性形式酶分子大小相符合。在第1天和3天时，MMP9活动性上升，第5天就变弱了，7天显著升高。同时作为对照的正常组织进行检测时没有相对应的MMP9条带。另外，其他的两个MMPs在该分析胶中没有检测到分子大小相对应的条带。 综上，在形态组织学上，蝾螈趾再生与其附肢再生很相似，都属于割处再生。MMPs的表达模式说明MMPs在再生过程中的伤口愈合及早期芽基形成发挥作用。可以肯定地说，本研究为趾再生研究提供了一定的参考。
墨西哥钝口螈;趾部再生;形态组织学;基质金属蛋白酶;时空表达模式
中国海洋大学
硕士
生物工程
梁宇君
2015
中文
Q959.520.4
80
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）