鳗弧菌MHK3株T6SS的功能性表达及抗菌特性
鳗弧菌（Vibrio anguillarum）是重要的海水养殖动物病原菌，广泛生存于各种不同的海洋环境中。海洋细菌具有多种适应海洋环境的策略，而鳗弧菌适应海洋生态环境的机制研究不多。细菌的Ⅵ型分泌系统(T6SS)是一种新的蛋白分泌系统，在许多海洋细菌的致病性和环境适应性方面发挥重要作用。本文开展了鳗弧菌MHK3株T6SS的表达及其介导的抑菌作用的研究，旨在深入了解鳗弧菌的生态适应机制。主要的研究内容和结果如下: 1.不同培养条件对鳗弧菌MHK3 T6SS表达和分泌功能的影响。Hcp（溶血素共调蛋白）是依赖T6SS分泌的一个基质蛋白，有T6SS的细菌能够将Hcp分泌到细菌外是T6SS具有功能的一个重要特征。在实验室适宜培养条件下，鳗弧菌MHK3的T6SS具有分泌Hcp的功能。本研究利用qRT-PCR和Western bolt方法，分析MHK3在各种温度(10℃、16℃、28℃、37℃)、盐度(0.2％、0.5％、1.0％、3.0％、5.0％NaCl)和pH(6、7、8、9、10)条件下表达和分泌Hcp的特征。结果显示，Hcp在10-37℃培养时均可表达和分泌，在转录水平上，Hcp mRNA表达量随温度升高而降低，在10℃的表达量最高;在蛋白水平上，胞内Hcp蛋白量在10-37℃变化不大，而胞外Hcp蛋白量在10-28℃较高，在37℃较低。Hcp在0.2-5％NaCl均有表达和分泌，在转录水平上，Hcp mRNA表达量在3％NaCl条件下最高，在其它盐度条件下的表达量均较低;在蛋白水平上，胞内和胞外Hcp蛋白量在0.5-5％NaCl均较高，在0.2％NaCl条件下较低。Hcp在pH6-10均有表达，在转录水平上，Hcp mRNA表达量在pH8时最高;在蛋白水平上，胞内和胞外的Hcp蛋白量随pH提高而减少，在pH10时MHK3不分泌Hcp。蛋白稳定性实验结果显示，分泌到胞外的Hcp蛋白8h内保持稳定而不降解。上述结果表明，在海洋环境的物理因子变化较剧烈的条件下，鳗弧菌依然能够表达和分泌Hcp，发挥T6SS的分泌功能。 2.密度感应系统调节基因luxO对MHK3 T6SS表达和分泌的影响。构建了MHK3 luxO基因的缺失突变株（ΔluxO），研究发现在实验室培养条件下ΔluxO的生长速率变慢。通过qRT-PCR和Western blot比较分析MHK3野生株及突变株ΔluxO、ΔvasC（MHK3 T6SS结构基因vasC的缺失株）在不同生长时期（OD540nm=0.1、0.6、1.0、2.0）Hcp的表达和分泌。结果显示，与野生株MHK3相比，在整个生长期ΔluxO和ΔvasC的Hcp mRNA转录水平很低，ΔluxO的胞内和胞外没有检测到Hcp蛋白，而仅在ΔvasC胞内能检测到Hcp蛋白。这些结果说明，luxO基因在转录水平上影响hcp基因的表达;vasC基因的缺失导致T6SS结构不完整，影响Hcp分泌到细胞外。 3.鳗弧菌MHK3 T6SS介导的抑菌作用。分别建立野生株MHK3（T6SS具有分泌Hcp的功能，Hcp+）及其突变株ΔluxO(T6SS没有分泌Hcp的功能，Hcp)、ΔvasC(Hcp)与大肠杆菌(Escherichia coli)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)的共培养体系，相互作用4h后进行细菌计数。结果显示，在MHK3(Hcp+)与E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的共培养体系，MHK3(Hcp+)的数量没有明显变化，而E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的细菌数量下降2-3 logs;在ΔluxO(Hcp-)或ΔvasC(Hcp-)与E.coli(Hcp-)或E.tarda(Hcp-)的共培养体系，所有的细菌数量没有明显变化。上述结果表明，T6SS介导鳗弧菌MHK3抑制E.coli和E.tarda的生长。
鳗弧菌;蛋白分泌系统;功能性表达;抗菌特性
中国海洋大学
硕士
生物工程
莫照兰
2015
中文
S917.1
75
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）