海洋来源化合物对神经细胞保护活性的筛选及作用机制研究
心脑血管疾病是困扰人类健康的头号公敌，据不完全统计，全球每年约有1750万人死于心脑血管疾病，占所有死亡人数的1/3。艾美仕医药健康(IMS Health)研究机构估计，到2020年全球将有2500万人死于心脑血管疾病。而受困于心脑血管疾病的人群更是难以估计。 神经退行性疾病是心脑血管疾病的重要分支，其主要表现为大脑和脊髓神经元随着人体老化而逐渐死亡所产生的认知以及运动功能性障碍，目前的研究尚不能清楚解释发病的原因和机理。目前发病率较高的三类神经退行性疾病为:阿兹海默症、帕金森症和肌萎缩侧索硬化症，其病症的初期表现分别为:短期记忆衰退、运动迟缓和肌无力，发展到后期会出现:记忆障碍、小脑萎缩和肌肉萎缩，严重影响了人类健康和生活质量。当前对于神经退行性疾病的研究还很有限，无法做的疾病治愈。市售药物主要集中在两类:拟神经递质类药物和神经递质代谢酶抑制剂，具有作用靶点单一、毒副作用大、易产生耐药性等缺点。因此，获得低毒性的替代治疗药物一直是研究热点，也是本论文的研究重点之一。 海洋药物资源有着广阔的开发前景，由于海洋特殊的理化环境，涌现了一大批结构新颖，功能特殊，具有成药前景的天然产物。壳寡糖是经甲壳质脱乙酰基后降解得到的天然产物，研究表明其具有良好的抗炎、抗氧化等药理活性，具有清除体内氧自由基，保护心脑血管，降低血脂等生物功能。目前已经作为保健食品批准上市，对于壳寡糖的诸多生理调节功能也在不断的探索研究之中;虾青素是一种非维他命原A的类胡萝卜素，主要存在于虾壳，鲑鱼和一些海藻体内。虾青素具有极强的抗氧化性，是维生素E的1，000倍，而且虾青素是目前唯一一种可以通过血脑屏障的胡萝卜素，这些特性使得虾青素成为一种非常理想的心脑血管保护药物;生物碱是泛指自然界中含氮的一类有机化合物，在海洋来源的次级代谢产物中占有相当的比重。海洋来源的生物碱活性非常广泛，如:抑菌，消炎，抗病毒，抗肿瘤等。此外有研究报道了海洋来源的生物碱，作为一种蛋白激酶抑制剂具有神经保护的作用。可以预见，随着研究的深入，海洋这一巨大的宝库会为人类的健康事业带来更多的惊喜。 糖胺聚糖，是一种直链、带有负电的多糖类大分子，主要存在于细胞外基质和细胞膜，是蛋白多糖的主要组成成分，糖胺聚糖按照二糖结构又可以分为以下几种:肝素/硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸皮肤素，透明质酸和硫酸角质素等。肝素是已在临床上使用了近80年的抗血凝药物，也是世界上产量和销售额最大的糖类药物，由其衍生出的肝素类药物2009年全球销售额已达69亿美金，而近年来肝素类药物的销量更是以年平均20％的速度在递增。硫酸软骨素则被用于关节炎的治疗而透明质酸因其良好的保水性和组织相容性，广泛用于美容和眼科手术中。 研究表明，糖胺聚糖的作用靶点主要位于细胞外，不仅参与血液循环系统、神经系统及免疫调节，而且涉及到细胞粘附、识别以及信号转导等生理活动。在神经系统的发育过程中，糖胺聚糖同样有着举足轻重的作用，研究表明Ext是小鼠合成HS的关键酶，研究人员利用敲除技术，敲除经由Nestin-Cre介导的Ext后发现小鼠大脑的发育从三个方面被扰乱:1、大脑的区域划分混乱，没有硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate，HS)的情况下，小鼠的中脑和小脑的区域无法完全分离，这是因为细胞表面的HS起到形态发生素(morphogen)信号转导的作用，并且可以保护形态发生素免于被降解;2、大脑皮层神经元的生长受到抑制，大脑皮层神经元的生长主要发生在胚胎阶段，且受到多种生长因子的调控，这其中包括FGF家族，而已有的研究证明FGFs是受HSPG调控的;3、神经细胞轴突的引导作用受阻，目前机理研究尚不十分明确，有观点认为HS可能是起到环境因素的作用，控制引导分子的分布。此外，糖胺聚糖在神经元的损伤修复中也扮演了重要的角色。Del等人报道了脑部受损后，利用硫酸软骨素酶处理神经元网络促轴突的再生;Butler等人发现硫酸角质素蛋白多糖对于海马区的苔藓纤维有引导作用。 然而，目前对于糖胺聚糖在神经学领域的探索主要集中在功能性研究，对于糖胺聚糖在神经细胞分化、发育过程中的组成和含量变化却鲜有报道。因此，对于糖胺聚糖在神经细胞分化过程中的含量和组成变化成为了本课题的研究目的之一。 PC12细胞是一种来自大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的体外培养细胞系，该细胞因为具有神经生长因子(nerve growth factor，NGF)受体，对NGF具有可逆的神经元分化作用，表现出交感神经元活性。被广泛的应用于体外神经系统分化和病理学研究。我们利用PC12细胞的这种体外分化特性，研究了细胞分化过程中细胞形态、蛋白表达水平和细胞表面糖胺聚糖含量组成的变化;同时利用分化型的PC12细胞构建了神经细胞谷氨酸盐(glutamate)损伤模型，对具有神经细胞损伤保护功能的潜在化合物进行了筛选。主要的研究结果和结论如下: 一、从细胞分化率和轴突伸展长度两方面综合考虑NGF的作用浓度为20 ng/ml。高于此浓度(50，100 ng/ml)时，细胞的神经突伸展明显，但是分化后期的细胞整体分化率较低。 二、在加入NGF诱导分化的早期(0-6 h)，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的ERK信号通路会被快速(＜10 min)激活，同时钙调蛋白依赖蛋白激酶(calmodulin-dependent protein kinase，CaMK)也表现出相似的表达规律。 三、 NGF的加入会影响PC12的细胞周期，免疫蛋白印迹实验和流式细胞实验结果表明，细胞周期被阻滞在G1期。同时，NGF分化96 h后免疫荧光结果显示神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)显色呈阳性结果，表明细胞的神经元诱导分化表型成功。 四、利用分化型PC12细胞构建了神经细胞损伤模型，以4mM glutamate为损伤剂，进行了一系列具有潜在神经细胞保护作用的化合物筛选，以及相关作用机理的研究工作:1）经过乙酰化修饰的甲壳胺表现出良好的抗细胞凋亡作用，这一现象只在全乙酰化的甲壳胺修饰改造物上出现，未修饰和N-乙酰化修饰的甲壳胺均不具有抗神经细胞凋亡作用。研究发现:全乙酰化的甲壳胺能够，i.降低细胞内乳酸脱氢酶(LDH)和活性氧族(ROS)的水平，ii.减少凋亡蛋白caspase-3和caspase-9酶的活性;降低BAX蛋白的表达量，减少BAX/Bcl-2的相对比值。2)天然产物虾青素显著提高了PC12的细胞存活率，研究表明:虾青素可以，i.有效降低Ca2+内流，ii.稳定线粒体膜电位，阻止细胞凋亡，iii.减少核素NfκB的入核现象，降低细胞色素C的释放。3）对68例新合成的化合物进行了活性筛选，研究了化合物与活性之间的构效关系，结果表明在合适的位置引入甲氧基(-OCH3)能够有效的提高化合物的抗细胞凋亡活性。 五、提取出未分化和不同分化状态的PC12细胞糖胺聚糖，利用HPLC和HPLC-MS进行单糖组成和含量的研究。 本文利用神经细胞保护模型对活性化合物筛选并探讨了相关作用机制，对化合物的合成和改造工作提供了生物学支撑，旨在为探索和开发治疗神经退行性疾病的药物提供有效的思路和依据。并从单糖含量和二糖组成的角度来阐述糖胺聚糖在神经细胞分化过程中的变化，尝试从不同的方面来理解糖胺聚糖在细胞分化发育中的作用。
神经退行性疾病;海洋化合物;药理活性;神经细胞保护
中国海洋大学
博士
药物化学
张丽娟
2015
中文
R741.05;R282.77
144
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）