斑马鱼卵黄原蛋白单/多克隆抗体的制备及其在环境雌激素检测中的应用
近年来，环境雌激素对野生动物生殖系统的危害受到了研究者的广泛关注，为了筛选出具有雌激素活性的化学物质，OECD与美国EPA建立了以鱼类为受试生物，以卵黄原(Vitellogenin，Vtg)为主要指标的筛选测试导则。斑马鱼(Daniorerio)是导则中推荐的重要模式鱼种之一，其Vtg的检测多采用导则中推荐的两种不同的酶联免疫吸附实验方法(ELISA)。Vtg诱导量的准确测定是正确评价化合物雌激素活性的重要前提，然而目前常用的测定方法和实验用鱼都可能会干扰Vtg的准确定量。为了确定高稳定性、高敏感性的斑马鱼Vtg ELISA检测方法，本研究对实验所用的抗原、抗体以及实验的方案、操作步骤进行了比较与优化;为了确定合适的实验用鱼，本研究检测了母源卵黄蛋白与新生成Vtg在斑马鱼发育过程中的变化情况，以寻找不含有Vtg的发育时期。此外，本研究还利用Octet生物分子相互作用系统建立了斑马鱼Vtg的生物传感器技术，为环境雌激素的筛选提供了简便、快捷的检测手段。本研究首先分离纯化了斑马鱼Vtg与卵黄脂磷蛋白(lipovitellin，Lv)，分析了它们的糖磷脂基团、分子量、氨基酸组成等基本性质及其在加热处理、-80℃长期保存与反复冻融条件下的稳定性，并制备了兔抗Vtg多克隆抗体、兔抗Lv多克隆抗体与Lv单克隆抗体。在检测了抗体的效价、特异性以及斑马鱼Vtg与Lv免疫同源性的基础上，利用纯化的Vtg、Lv与制备的多种抗体开发了斑马鱼Vtg的多种ELISA方法和生物传感器检测技术，并确定了斑马鱼发育过程中的Vtg空白期。本研究旨在通过对斑马鱼Vtg定量方法的优化与实验用鱼合适发育时期的确定，为准确评价化学物质的雌激素效应提供可靠的实验方案。本文研究结果表明: (1)利用凝胶过滤、离子交换层析、超滤相结合的方法从100 ng/L17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)暴露7天后斑马鱼的整体匀浆液中纯化出了分子量分别为483 kDa与458 kDa的两种Vtg。特异性染色结果表明两种Vtg均为糖磷脂蛋白，MALDI-TOF/TOF-MS鉴定结果显示两种Vtg由不同的Vtg基因编码，且具有很高的同源性。利用纯化的Vtg与制备的高特异性Vtg多克隆抗体建立了斑马鱼Vtg的竞争ELISA和夹心ELISA。与竞争ELISA相比，夹心ELISA不仅操作简便，还具有更高的精确度与敏感度，更加适合用于斑马鱼Vtg的准确定量。夹心ELISA的检出限约为2.2 ng/mL，工作范围为3.9～250 ng/mL，组内与组间变异系数则分别为2.1～5.7和3.0～7.3。随后，利用Westem blot与夹心ELISA检测了母源卵黄蛋白与新生成Vtg在发育过程中的变化，确定了斑马鱼的Vtg空白期(9 dph至56 dph)。最后，利用夹心ELISA测定了E2暴露对孵化后21天幼鱼Vtg的诱导效应，验证了该时期幼鱼在环境雌激素检测中的应用。 (2)利用凝胶过滤与离子交换两步层析法从卵巢匀浆液中纯化获得了斑马鱼Lv。斑马鱼Lv是分子量约为445 kDa的糖磷脂蛋白，与其它鱼Lv具有相似的氨基酸组成，在SDS-PAGE中显示分子量分别为117 kDa与102 kDa的两个亚基;与Vtg相比，斑马鱼Lv在高温处理、-80℃长期保存以及反复冻融等条件下均未发生降解，表现出很好的稳定性。免疫学实验表明，制备的兔抗Lv多克隆抗体对斑马鱼Vtg具有很高的特异性、Lv与Vtg具有相同的免疫原性，并且以高稳定性的Lv代替Vtg用作抗原能够显著提高ELISA方法的精确度。基于Lv建立的斑马鱼Vtg夹心ELISA，其检出限为4.3 ng/mL，工作范围为7.8～250ng/mL，组内与组间变异系数均小于10％。通过检测久效磷暴露后斑马鱼幼鱼的Vtg诱导量进一步验证了该方法在环境雌激素筛选中的应用。 (3)成功制备了两种识别不同抗原决定簇的斑马鱼Lv单克隆抗体，并建立了斑马鱼Vtg的两种夹心ELISA。与多克隆抗体相比，利用单克隆抗体建立的ELISA具有更高的敏感度，检出限约为0.78 ng/mL，工作范围为1.95～250 ng/mL。E2诱导雄鱼匀浆液在ELISA中的连续稀释曲线与Lv标准曲线之间具有很好的平行性，证明该方法可以用于斑马鱼Vtg的定量。随后利用基于Lv单克隆抗体建立的两种ELISA测定了E2暴露14天后斑马鱼幼鱼的Vtg诱导量。 (4)利用纯化的Lv与兔抗Lv IgG组分在Octet生物分子相互作用系统上开发了斑马鱼Vtg的生物传感器检测方法。该方法操作简单、分析速度快、无需标记，可在15 min之内完成样品Vtg的测定，其工作范围为78～5000 ng/mL，组间变异系数为1.13％。通过测定E2暴露后斑马鱼Vtg的诱导量，证实了该方法在雌激素效应检测中的应用。 综上，本研究建立并比较了斑马鱼Vtg的间接ELISA与夹心ELISA方法，发现高敏感性、高精确性的夹心ELISA方法更加适合用于鱼类Vtg的测定;并且通过测定Vtg在发育过程中的变化确定了斑马鱼的Vtg空白期，为实验用鱼的选择提供了依据。本研究证实斑马鱼Lv不仪与Vtg具有相同的免疫源性，还表现出很高的稳定性，将Lv用作ELISA的标准品可提高检法方法的稳定性，有助于保证鱼类Vtg的准确定量。本研究还首次制备了高效价、高特异性的斑马鱼Lv单克隆抗体，并且发现基于单克隆抗体建立的夹心ELISA要比基于多克隆抗体建立的ELISA具有更高的敏感度，高均质性单克隆抗体的制备有助于斑马鱼Vtg标准化检测方法的建立。此外，本研究还利用Octet生物分子相互作用仪首次建立了快速测定斑马鱼Vtg的生物传感器技术，可以作为ELISA的有效补充手段用于环境雌激素的检测。以上研究结果可为现有测试导则的完善提供重要的方法学参考。
卵黄原蛋白;单克隆抗体;多克隆抗体;制备工艺;环境雌激素
中国海洋大学
博士
生态学
汝少国;王蔚
2015
中文
Q813.2
104
2016-03-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）