美洲牡蛎(Crassostrea virginica)抗病相关基因标记的筛选及应用
美洲牡蛎(Crassostrea virinica)天然分布于大西洋西岸和墨西哥湾,是美国重要的经济贝类。上个世纪中期,美洲牡蛎曾遭受两种原生动物病害(MSX和Derrno)的重创,无论养殖群体还是野生群体,均出现高感染率、高死亡率的现象,这使美国东海岸的养殖业几乎崩溃。本研究通过候选基因法和RAD测序的方法筛选美洲牡蛎抗病相关基因标记,并利用已知抗病相关的分子标记和中性的分子标记分析寄生虫病对特拉华湾美洲牡蛎群体遗传结构的影响。 1.丝氨酸蛋白酶抑制因子1基因(cvSI-1)和美洲牡蛎抗病性状的相关性通过分析美洲牡蛎cvSI-1基因的SNV198位点在抗病品系、易感品系及其野生基群体,具有不同病害感染史的野生群体和处于同一流域,但具有不同病害选择压力的野生群体中和抗病性状的相关性,本研究发现SNPl98位点C等位基因和美洲牡蛎的抗Dermo性状紧密相关。但SNP198是个同义突变,不改变编码氨基酸的序列,所以本研究还分析了SNP198位点和cvSI-1基因5'调控区多态性位点的连锁性来解释其抗病相关性。通过染色体步移和重测序的方法,获得长631 bp的5'调控区,包含22个SNPs和3个插入/缺失多态性位点。利用野生群体死亡前和死亡后的材料,分析5'调控区-404位,长25 bp的插入/缺失位点和SNP198位点的连锁性。在Dermo造成大部分死亡的死亡后群体中,-404插入/缺失的缺失等位基因上升了14.4％(p=0.0595),而SNP198的C等位基因仅上升了3.4％(p=0.5756)。缺失等位基因和C等位基因在80.3％的牡蛎中具有连锁性。具有缺失等位基因的牡蛎经Dermo病原体Perkinsusmarinus感染后,其cvSI-1的表达量显著提高(p=0.017)。本研究结果提示我们,5,调控区的变异会提高cvSI-1的转录活性,因此通过抑制寄生虫的蛋白酶活性而对其产生抗性。 2.丝氨酸蛋白酶抑制因子2基因(cvSI-2)和美洲牡蛎抗病性状的相关性一种新的丝氨酸蛋白酶抑制因子,cvSI-2,已经从美洲牡蛎的细胞质中分离出来,其能够体外抑制P.marinus的活性。本研究分析了cvSI-2基因的多态性和美洲牡蛎抗病性状的相关性。利用cvSI-2的cDNA序列搜索NCBI数据库,共得到33条美洲牡蛎的EST序列。将低质量的序列去除后,27条高质量的EST序列用于比对和SNP位点的筛查,获得5个高质量SNP位点,包括4个同义突变和1个非同义突变。随后,对非同义突变SNP226(A/G)和美洲牡蛎的抗病相关性进行分析。SNP226的GG基因型在两个家系死亡后的材料中分别上升17.0％(p=0.0005)和16.9％(p=0.0634)。另外,SNP226的G等位基因在选育的抗病品系中的频率最高,为93.5％,显著高于其野生基群体CTW(69.6％)和两个选育的易感品系FMF(63.0％)和UMFS(51.3％)。在Martha's Vineyard、特拉华湾和切斯皮克湾三个不同水域,病害选择压力大的野生群体G等位基因频率都要高于病害选择压力小的群体。SNF226的G等位基因编码缬氨酸,A等位基因编码异亮氨酸。此位的缬氨酸可能能够增强cvSI-2蛋白和Dermo病原体丝氨酸蛋白酶结合的亲和性,从而增强了抑制其活性的能力,最终在美洲牡蛎的抗Dermo病害方面发挥重要作用。 3.美洲牡蛎高密度遗传连锁图谱的构建及抗病性状的QTL定位利用RAD测序技术,构建了美洲牡蛎高密度遗传连锁图谱。通过分析标记死亡前后基因型频率的变化,定位抗病性状相关的QTL。雌性连锁图谱含12个连锁群,共1,350个标记,覆盖1,081.24 cM,最大图距12.24 cM,平均图距0.80 cM,覆盖率为98.14％。雄性连锁图谱含10个连锁群,共1,236个标记,覆盖723.61 cM,最大图距10.05 cM,平均图距0.59 cM,覆盖率为98.28％。雌性图谱中,88个标记在死亡后群体中基因型频率发生显著变化(p<3.74×10-5,经Bonferroni校正后的P值),其中有62个(76.30/％)标记是成对或者成簇分布。雌性图谱检测到11个高精度QTL,分布在5个连锁群,其中第8号连锁群的QTL数目最多,为4个。雄性图谱中,80个标记在死亡后群体中基因型频率发生显著变化(p<4.04×10-5,经Bonferroni校正后的P值),其中有57个(71.3％)标记是成对或者成簇分布。雄性图谱检测到5个高精度的QTL,分布在4个连锁群,在第7号连锁群检测到2个。 4.病害对特拉华湾美洲牡蛎幼体群体遗传结构的影响本研究利用8个抗病相关的SSR标记和9个中性的SSR标记对特拉华湾由北向南Hope Creek(HC)、Round Island(RI)、Beadons(BD)及Cape Shore(CS)4个采样点的美洲牡蛎幼体群体进行了群体遗传学分析。如果用17个微卫星位点分析两两群体间的遗传分化系数(Fst),Fst的分布范围为-0.0016-0.0015。最南部群体CS和最北部群体HC间的Fst值最大,为0.0015,但是和0没有显著性差异(p>0.0083,经Bonferroni校正后的P值)。如果用8个抗病相关的微卫星位点进行分析,Fst的分布范围为-0.0052-0.0013。CS群体和HC群体间的Fst值最大,为0.0013。但是其Fst值仍和O没有显著性差异(p=0.8417)。同样地,中性的微卫星位点也没有检测到这4个群体间的遗传分化。这说明特拉华湾幼体群体是个均一的大群体,没有出现遗传分化。 5.特拉华湾美洲牡蛎群体有效群体大小(Ne)的估算具有高繁殖力和I1l型存活类型的美洲牡蛎中极有可能存在“少数个体维持大群体”的现象。为了验证特拉华湾美洲牡蛎群体中是否存在这种现象,本研究估算了其有效群体的大小(Ne),并比较特拉华湾的Ne在不同病害选择压力群体间和时间上的变化。对特拉华湾5个采样点,2006年和2009年成体牡蛎和幼体牡蛎群体样品在7个中性的SSR位点进行分型,利用三个双样品法和两个单样品法估测特拉华湾美洲牡蛎群体的Ne。结果显示,成体牡蛎和幼体牡蛎间的基因丰富度没有显著性差异,从而不支持“少数个体维持大群体”,的理论。5种方法估算得到的Ne值差异较大,总体而言,所得Ne值较小,并且通常没有获得有效的上限估算值。幼体群体的Ne值分布范围是140-440,比成体群体的Ne值要小(589-2,779)。通过混合所有成体的样品所估算的Ne值提示着整个海湾的有效群体大小可能较大。本研究结果表明,特拉华湾某一批幼体牡蛎可能是由少数的成体牡蛎繁殖而来的,并存在一定的遗传漂变。但是这种小范围的遗传漂变并不影响整个湾成体群体的遗传变化,因为成体群体是每年很多批幼体群体积累多年的结果。
美洲牡蛎;抗病基因;遗传连锁图谱;分子标记;群体分化;抗病品系筛选
中国海洋大学
博士
海洋生物学
包振民;郭希明
2012
中文
S944.41;S961.6
152
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）