鱼类卵黄高磷蛋白衍生抗菌肽的免疫调节功能的研究
在鱼类对外界刺激及病原物侵袭的防御反应中,非特异性免疫起着重要作用。抗菌肽(AMPs)作为效应分子在宿主防御抵御病原体中扮演一个重要的天然免疫中的作用,当机体遇到病原体入侵时,以活体形式由相应的细胞合成并释放出来.发挥抗菌作用及其它生物学功能,在鱼体与病原生物不断抗争的过程中起到固有防御的作用。抗菌肽除去具有抗菌功能,还普遍具有免疫调节功能。 本论文是以前发现的卵黄高磷蛋白Pv具有免疫防御作用的研究基础上,特别是发现Pv截断形成的小分子也具有抗菌活性的基础上,开展Pv免疫调节作用的研究。目前,已经有大量关于抗菌肽在鱼类的免疫防御中发挥功能的研究报道,但在免疫调节方面的作用及其机理的研究极其少见。我们从以下几个方面探讨了Pv衍生的抗菌活性肽Pt5在鱼类对抗病原菌感染中的免疫功能及其机理:一、建立斑马鱼败血症模型通过腹腔注射重组表达的抗菌肽Pt5是否具有免疫保护和调节功能,二、通过分子生物学手段研究抗菌肽在斑马鱼受到病原菌侵害时,对斑马鱼体内免疫调节和保护作用的机理。 首先,在原核重组表达抗菌肽Pt5的过程中,利用近年来Studier等人提出的先进的外源基因自诱导表达策略无论在产出蛋白的质量还是数量上都比传统方法都有很大提高,克服了具有细胞毒性抗菌肽表达量小,多在包涵体中表达的不足,充分保留了融合蛋白的活性,为后续的内体实验奠定了基础。 其次,通过建立嗜水气单胞菌A.hydrophila弓l起的斑马鱼败血症模型,研究了具有抗菌活性的蛋白小肽Pt5在急性细菌性鱼类败血症中的生物学功能。结果显示急性细菌感染后,Pt5注射组斑马鱼的存活率较对照组和无活性的Pt5突变体M13注射组都显著提高,并且显著降低了组织器官的染菌数量,通过对斑马鱼外周血细胞的检测,发现Pt5注射组能调节病原菌感染斑马鱼免疫细胞的变化,缓解宿主体内强烈的炎症反应,减轻斑马鱼病原菌感染的症状,对斑马鱼在急性病原菌感染中起到了保护性作用。 为明确Pt5在斑马鱼急性感染中的作用机制,通过荧光实时定量技术,注射抗菌蛋白Pt5后,检测斑马鱼体内免疫相关的促炎细胞因子和抗炎症细胞因子在两个重要免疫器官脾、头肾组织中的表达变化。结果表明,外源菌感染的情况下,Pt5注射组在注射后6h和12h能显著降低四种促炎症因子基因il-lβ,il-6,tnf-a和ifn-γ表达量,而M13、注射组和PBS注射组在感染病原菌后,促炎症细胞因子mRNA则大量表达。在对抗炎症因子的表达影响中,Pt5注射12h后,Pt5能显著提升抗炎症因子基因il-10和il-4的表达量。 综合以上实验结果,我们认为大剂量的抗菌肽Pt5在斑马鱼细菌性感染过程中所起到的免疫调节和保护作用,可能是直接地杀死病原菌,而不是通过激活鱼体内炎症反应来抵抗病原菌的急性感染,在体内炎症反应加剧的时候,能够发挥免疫调节机制,降低促炎症反应的效应因子,并诱导抗炎症反应的效应因子的产生,从而有效降低过度的炎症反应,防止斑马鱼在急性细菌感染中产生的感染性休克症状,从而保护斑马鱼在原菌侵染中的生存率。 本实验第一次揭示了鱼类卵黄高磷蛋白Pv衍生抗菌肽Pt5在鱼类对抗病原菌感染过程中所起到的免疫保护作用和免疫调节机制,具有杀死病原菌和降低炎症反应的双重功效。这一研究结果具有重要的潜在应用价值。
斑马鱼;卵黄高磷蛋白;抗菌肽;免疫调节;非特异性免疫;免疫保护
中国海洋大学
博士
海洋生物学
张士璀
2012
中文
S942.5;S941.413
111
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）