中国明对虾血蓝蛋白的组织分布特点及白斑症病毒感染后血蓝蛋白含量的变化
本论文应用抗中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血蓝蛋白单克隆抗体,研究血蓝蛋白在中国明对虾鳃、心、胃、中肠、淋巴器官、卵巢和肝胰脏等组织器官中的分布特点;用不同浓度白斑症病毒(WSSV)感染中国明对虾,测定血淋巴中血蓝蛋白和总蛋白含量的变化。旨在为血蓝蛋白抗WSSV感染免疫作用机制的研究提供基础数据。主要包括以下3部分: 1.抗中国明对虾血蓝蛋白单克隆抗体的特性分析及抗原抗体最佳使用稀释度的确定 复苏抗中国对虾血蓝蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株2H3,收集细胞培养上清,以中国明对虾血淋巴上清液为抗原,用Western-blotting法对单抗2H3进行特性分析,并通过棋盘法滴定法确定酶联免疫吸附检测(ELISA)中抗原抗体最佳稀释倍数。结果表明:单抗2H3可与中国对虾血蓝蛋白的分子量分别为73 kDa和75 kDa的两个亚基发生特异性反应;ELISA中抗原抗体的最佳使用稀释倍数分别为10-4和2-2。 2.中国明对虾血蓝蛋白的组织分布特点 以筛选出的单抗2H3为第一抗体,采用石蜡切片、免疫组化方法,研究血蓝蛋白在中国明对虾鳃、心、胃、中肠、淋巴器官、卵巢和肝胰脏等组织器官中的分布特点。结果表明:血蓝蛋白在各组织器官中均有分布,在鳃丝小叶边缘的微血腔、心肌束间隙、淋巴器官的淋巴腔中以及肝小管中阳性信号较强:在卵巢卵母细胞之间的血窦、胃内壁环肌层结缔组织的血窦和中肠结缔组织血窦中有阳性信号。结论认为,中国明对虾血蓝蛋白阳性信号大多来自血淋巴而非实质组织,且在血淋巴含量多、血流量大的部位含量丰富,在某些血淋巴无法到达的部位(肝小管内壁等)也有血蓝蛋白分布,血蓝蛋白含量的这种组织特异性与各组织器官的功能有着密切的联系。 3.白斑症病毒感染后中国明对虾血蓝蛋白含量的变化 取患白斑症的螯虾鳃,每克鳃组织加10 ml磷酸缓冲液匀浆,离心、过滤后以滤液为病毒粗提母液,稀释至10-2,10-4和10-6作为WSSV注射液,注射感染中国明对虾,绘制存活率曲线。实验证明以10-2、10-4和10-6这三个病毒稀释度感染中国明对虾,不仅可以保证实验动物均被成功感染上病毒,也可以保证实验过程中不同时间段均有足够的存活对虾可供取样。 分别以10-2,10-4和10-6 WSSV粗提液尾节肌肉注射感染中国明对虾,分别在感染后0 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h和72 h取样。 取对虾鳃组织,two-step PCR检测WSSV。10-2 WSSV感染组在WSSV感染后12 h于鳃中检出病毒,10-4 WSSV感染组在感染后12 h被第二步PCR检出病毒,10-6 WSSV感染组在感染后24 h被第二步PCR检出病毒。 抽取血淋巴,ELISA测定血蓝蛋白的含量。结果显示,在10-22WSSV感染组,感染后6 h血蓝蛋白含量显著上升(A405nm=0.74±0.036,ANOVA,p＜0.05)并在12 h达到最高值(A405nm=0.77±0.047,ANOVA,p＜0.05),在24 h降至对照水平,随后持续下降并显著低于对照组,直到72 h达到最低值(A405nm=0.18±0.046,ANOVA,p＜0.05)。在10-4和10-6WSSV感染组,血蓝蛋白含量在感染后0 h,6 h,12 h和24 h无显著变化,从36 h起显著低于对照组,持续下降至72 h达到最低(10-4:A405nm=0.23±0.053:10-6:A405nm=0.22±0.050,ANOVA,p＜0.05)。 考染法测定血淋巴总蛋白的含量。结果显示,在10-2,10-4和10-6 WSSV感染组中,血淋巴总蛋白含量均在感染WSSV后6 h显著高于对照组,并在12 h达到最大值(10-2:108.18±1.36 mg/ml;10-4:103.49±1.33 mg/ml;10-6:96.94±1.06 mg/ml,ANOVA,p＜0.05),在72 h显著低于对照组(10-2:86.95±0.52 mg/ml;10-4:89.27±0.76 mg/ml;10-6:85.98±0.71 mg/ml,ANOVA,p＜0.05)。 实验结果表明,随着WSSV感染程度的加深,血蓝蛋白含量总体呈下降趋势,高浓度WSSV(10-2)感染组血蓝蛋白含量在感染初期显著上升,而中、低浓度(10-4、10-6)WSSV感染组血蓝蛋白含量无显著升高,说明在WSSV的感染过程中血蓝蛋白含量的变化呈现出剂量依赖的特性,WSSV感染与血蓝蛋白密切相关。
中国明对虾;血蓝蛋白;组织分布;白斑症病毒
中国海洋大学
硕士
水生生物学
邢婧;战文斌
2012
中文
S945.46
65
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）