急性病毒性坏死病毒分子流行病学调查及奥尔森帕金虫环介导等温扩增检测方法的建立
栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海主要的贝类养殖品种之一。“急性病毒性坏死病毒”(Acute Viral Necrosis Virus;AVNV)经证实是一种能对栉孔扇贝造成极大危害的病原体。本文应用PCR检测方法,对青岛流清河湾和荣成桑沟湾养殖栉孔扇贝、养殖设施大型附着污损生物及在全国6省14个养殖海区采集到的贝类样品进行AVNV检测分析,以探讨AVNv在全国的分布、可侵染宿主、感染增值规律以及可能的传播途径。同时,建立了奥尔森帕金虫(Perkinsusolseni,P.olseni)环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)并进行应用,从而为贝类健康养殖模式的探索、提出以及建立贝类大规模死亡的疾病防疫模式奠定理论和技术基础。 本文应用PCR方法连续一周年检测两个不同贝类养殖海区栉孔扇贝样品携带AVNv的情况。检测结果显示,2010年青岛流清河湾样品在8月份AVNV阳性检出率最高,栉孔扇贝野生苗和蓬莱红分别高达60％和30％,栉孔扇贝的 AVNV阳性检出率与栉孔扇贝大规模死亡流行病学特征具有正相关性,高温(7月、8月和9月份海水平均温度23℃以上)可能是导致AVNV侵染栉孔扇贝并致其死亡的重要环境胁迫因子;桑沟湾扇贝养殖海区属于贝藻混养海区,全年栉孔扇贝的AVNV阳性检出率均较低,栉孔扇贝样品的AVNV阳性检出率最高时间为2010年8月,蓬莱红、人工育苗和野生苗AVNV阳性检出率分别为20％、10％和20％。2010年流清河扇贝养殖场野生苗和蓬莱红存活率分别为37.41％和61.33％;桑沟湾扇贝养殖海区蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为96.67％、92.5％、94.17％,表明贝藻混养的养殖模式与单一养殖模式相比,可以保持养殖海区的生态环境在一个稳定可持续发展的状态,抑制AVNV侵染栉孔扇贝或阻止AVNV的传播,从而降低栉孔扇贝发病率。 对2010-2011年青岛流清河湾与荣成桑沟湾两个不同海区养殖栉孔扇贝的扇贝养殖设施上常见的几种大型附着污损生物进行检测,以探讨其能否携带AVNV,是否为AVNV的潜在宿主,以及AVNV传播过程中污损生物所起的作用。两个养殖海区中紫贻贝、麦秆虫和长牡蛎样品均检出AVNV阳性,青岛流清河湾养殖海区的东方缝栖蛤未检出有AVNV阳性,表明紫贻贝、麦秆虫和长牡蛎可携带AVNV,为AVNV的宿主,东方缝栖蛤与柄海鞘未检出AVNV阳性,可能不是AVNV的宿主。 自2010年5月至2011年12月间,从中国沿海6省14个养殖海区共采集24批次390份样品,其中包括9种主要海水养殖贝类,包括双壳纲贝类7种,腹足纲2种。使用PCR方法检测这些贝类样品AVNV携带情况,有5种贝类样品可携带AVNV,说明AVNV在养殖贝类中宿主范围分布较广泛,包括:近江牡蛎、长牡蛎、虾夷扇贝、翡翠贻贝和紫贻贝等;共有3种贝类样品未检测出AVNV阳性,包括海湾扇贝、皱纹盘鲍和黑鲍,但是受采样地点、时间和样品数量的限制,这些种类能否携带AVNV还需要进一步研究。 奥尔森帕金虫(Perkinsus olseni,P.olseni)是重要的贝类病原性寄生虫之一,为建立快速、准确、灵敏和使用简便的检测方法,本文根据P.olseni5.8S rDNA中的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列,使用在线设计软件Primer Explorer V4设计一套P.olseni LAMP引物,建立了环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对反应条件进行优化,最终确立P.olseni的25 uL L,AMP反应体系,且最佳反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min。本文根据P.olseni5.8S rDNA ITS序列构建阳性质粒,验证了该方法检测灵敏度约为30拷贝,且特异性良好,与海水帕金虫(Perkinsusmarinus)、包纳米虫(Bonamia exitiosa)、波豆虫(Ichthyobodo sp.)及AVNV等病原均无交叉反应。使用LAMP法对2批共20个菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)样品进行检测,结果表明LAMP检测与传统PCR检测相比,灵敏度更高,检测结果更准确,同时也表明P.olseni在北方贝类养殖区的主要养殖贝类中有较为广泛的分布。本文所建立的奥尔森帕金虫LAMP检测方法具有简单、快速、灵敏且特异性强等特点,可以在沿海贝类养殖厂及条件简陋的实验室使用。
栉孔扇贝;急性病毒性坏死病毒;流行病学调查;奥尔森帕金虫;环介导等温扩增技术
中国海洋大学
硕士
水生生物学
王崇明;潘鲁青
2012
中文
S944.43
71
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）