黄颡黄生殖相关基因的克隆、表达及对温度的响应
本论文以雌性黄颡鱼为研究对象,运用组织学、内分泌学方法和分子生物学方法,克隆了与其生殖相关的促性腺激素受体、P450c17I、芳香化酶和Sox9基因,并对时空表达和热应激响应进行了研究和分析。 1促性腺激素受体基因克隆与在雌鱼生殖周期中的表达 采用SmartTM Race技术,获得了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)促卵泡激素受体(FSHR)和促黄体激素受体(LHR)cDNA全长序列。其中FSHR全长2340bp,编码661aa,LHR全长2524 bp,编码701aa,均具有G蛋白偶联受体超家族(Gprotein-coupled receptor,GPCR)的保守结构:7个跨膜螺旋区(transmembranedomain)。经分析发现FSHR,具有9个富含亮氨酸的重复序列(LRRs);5个潜在的N-端糖基化位点;位于第一个包外环的蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化位点(403Y);并且在C-末端(C-terminal domain)G蛋白偶联区域,发现三个PKC磷酸化位点(634S,643S,632T);与FSHR的功能存在密切关系。而LHR中发现4个潜在的N-端糖基化位点;24个Ser,6个Thr和5个Tyr磷酸化位点;潜在的PKC位点为400S。通过RT-PCR发现FSHR在卵巢和脑中大量表达,在其他组织中少量或微量的表达;在卵巢发育周期中,FSHR在卵巢表达从Ⅲ期-Ⅳ期处于较高水平,脑中在Ⅵ期达到最高值。推测FSHR参与卵母细胞成熟及卵黄蛋白的积累。同时发现LHR在卵巢中大量表达,其次是脑、肾脏、心脏、肝脏和肠;在卵巢繁殖周期中,LHR在卵巢表达从Ⅲ期-Ⅴ期处于表达水平较高,Ⅴ期达到最高峰,随后下降到最低值;而脑中的表达高峰出现在Ⅳ期,与血浆中E2变化水平相一致。推测卵巢和脑中LHR参与卵黄蛋白的生成,调控卵母细胞的成熟以及参与排卵。 2黄颡鱼P450e17-Ⅰ cDNA克隆,雌鱼时空表达和热应激表达分析 P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)是类固醇激素合成的关键酶,在性腺类固醇和皮质醇的合成过程中起重要的调控作用。通过RT-PCR和Smart TM Race技术,我们克隆得到了黄颡鱼P450e17-Ⅰ cDNA全长2071 bp,共编码514aa,现已提交GenBank基因库,序列号为HQ832642.3。该序列具有跨膜区,P450c17特异保守区,Ozol's十三肽区和细胞色素P450半胱氨酸血铁红素配体信号区,四个典型的P450c17-Ⅰ特异性保守区域。通过半定量RT-PCR技术分析P450c17-Ⅰ基因的时空表达发现,CYP17-Ⅰ在卵巢和头肾的表达量最高,其次分别为脑、肝脏和胃,而在肾脏、鳃和脾脏中发现极为微弱的表达。在周期表达中发现,卵巢中CYP17-Ⅰ的变化趋势与T相似。在卵巢成熟期达到峰值,随后显著性降低。而脑中的表达趋势同卵巢趋势相反,CYP17-Ⅰ表达的最低值出现在Ⅴ期。在热应激表达中,除卵巢发育Ⅵ期,CYP17-Ⅰ与睾酮的含量变化相一致,而脑中的变化趋势没有相关性。说明CYP17-Ⅰ在卵母细胞发育和成熟期间对类固醇激素生成起到了关键的调控作用。 3细胞色素P450芳香化酶在雌性黄颡鱼在卵巢发育周期和热应激条件下的表达模式 本实验主要研究了在雌性黄颡鱼繁殖周期中起关键作用的两种P450芳香化酶。从组织的差异性表达发现CYP19B主要在脑和卵巢中大量表达,其中脑中的表达高于卵巢,而且在肠中也发现CYP19B的表达。CYP19A只在卵巢的存在特异性表达。利用半定量RT-PCR的方法分析发现在性腺发育周期中均存在较高的转录水平,且其表达模式与血浆E2水平相似。在每一卵巢发育阶段热应激表达实验中,我们发现在Ⅴ期和Ⅱ期热应激对两种亚型的表达,血浆E2和T的含量具有上调作用,从而促进卵母细胞的成熟、排卵和卵巢的再发育。在卵巢发育Ⅲ期阶段中,热应激则起到下调作用,可能参与抑制卵黄卵母细胞的发育。实验表明:两种芳香化酶亚型的表达与血浆E2和T水平存在的密切的联系,说明CYP19在卵巢发育周期中具有重要的作用,且热应激能够影响繁殖周期中卵巢的发育。P450atom将是研究黄颡鱼生理功能的重要的候补基因。 4 Sox9基因在黄颡鱼卵巢发育周期的表达及对热应激的响应 本文采用半定量PCR的方法,分别从时空表达,温度应激调控和血清雌二醇(estradiol-17β,E2)水平三个方面,共同研究雌性黄颡鱼Sox9的功能。结果表明:Sox9a1在雌性黄颡鱼各组织中存在广泛的表达,而Sox9a2则在脑和卵巢中有高表达(脑＞卵巢),胃中表达微弱。在卵巢年周期发育中,卵巢中Sox9a1在Ⅲ期时达到高峰,Sox9a2则在Ⅴ期时达到峰值;脑中Sox9a1和Sox9a2表达的最大值均在Ⅱ期,后随着卵巢的发育表达水平显著性下降。在热应激调控试验中,卵巢中Sox9a1虽然对热应激存在响应,但并没有出现E2相一致的变化趋势,而Sox9a2的变化趋势与血浆中E2相同。虽然脑中Sox9a1和Soxga2在卵巢年周期发育的表达变化出现下降的趋势,但在热应激条件下,脑中Sox9a1和Sox9a2在Ⅱ期与E2的变化相反,而Ⅲ期到Ⅵ期与E2的变化相一致。该实验结果表明:卵巢中Sox9a1可能并不参与卵巢的年周期发育,Sox9a2则参与卵巢发育的调控;在脑中,我们推测热应激可能改变了Sox9与雌激素的负调控关系,但其机理需要更加深入的研究。
黄颡鱼;促性腺激素受体;基因克隆;时空表达;热应激响应
中国海洋大学
硕士
水生生物学
温海深
2012
中文
S965.399
111
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）