凡纳滨对虾和三疣梭子蟹渗透调节相关基因的筛选与表达分析
水生甲壳动物的渗透调节机制一直是国内外学者研究的热点。本文利用SSH及RACE技术,通过对凡纳滨对虾及三疣梭子蟹渗透相关功能基因的筛选,克隆和表达研究,研究了盐度胁迫对渗透相关基因的表达影响,初步探讨了甲壳动物渗透调节机制,主要包括以下三方面内容: (1)盐度变化下凡纳滨对虾差异表达基因的筛选与鉴定、表达分析; (2)凡纳滨对虾两种碳酸酐酶的基因克隆与表达分析; (3)三疣梭子蟹两种碳酸酐酶的基因克隆与表达分析。主要结果如下: 1.盐度变化下凡纳滨对虾差异表达基因的筛选与鉴定、表达分析 本研究利用差异消减杂交(suppression subtractive hybridization;SSH)技术筛选盐度变化下凡纳滨对虾差异表达基因,并通过实时荧光定量PCR技术检测了盐度变化下这些基因的表达量变化。筛选得到与渗透调节,免疫,呼吸,代谢及信号转导相关的的基因主要有果糖磷酸激酶、粘附因子、假定蛋白S18_873_0036、假定蛋白BCW_A0010、细胞色素氧化酶亚型I、延长因子2,吡啶磷酸脱氢酶及对虾白斑病病毒基因等。 2.凡纳滨对虾两种碳酸酐酶的基因克隆与表达分析 本文克隆了凡纳滨对虾胞质碳酸酐酶基因(cytoplasmic carbonic anydrase,Cac)及磷脂酰肌醇连碳酸酐酶(glycosyl-phosphatidylinositol-linked carbonicanhydrase,Cag)的全长及部分序列。胞质碳酸酐酶基因全长1161bp,开放阅读框810bp,共编码270个氨基酸,分子量29.45kDa;磷脂酰肌醇连碳酸酐酶现有基因5撇端序列及片段序列908bp,开放阅读框778bp,编码268个氨基酸。 组织特异性分析可知,Cac在鳃丝、肌肉、肝胰脏及神经节内有较高表达,在血细胞内有少量表达,在心脏内不表达,Cag在鳃丝、肌肉及神经节内有较高表达,在眼柄及肝胰脏内有少量表达,在心脏及血细胞内不表达;进化树分析可知,凡纳滨对虾Cac与Cag是碳酸酐酶基因超家族的两个亚族,两者均与虾类亲缘关系最近,与斑节对虾在一个支上,与蟹类次之,与昆虫同属节肢动物门,而与脊椎动物亲缘关系较远,这说明碳酸酐酶进化中非常保守;另外DNA比对可发现氨基酸比对发现Cag在蛋白的N端比Cac多出一段22个氨基酸的序列,这即为Cag与细胞膜结合的信号肽区域。蛋白结构预测得知,Cac第80-100个氨基酸处为其Zn离子结合位点,Cag第105-120个氨基酸处为其Zn离子结合位点,附近有一个由Val、Leu、Tyr和Leu所构成的疏水口袋和由Thr和His所组成的一个质子转移通道,两种碳酸酐酶均由单一肽链组成,每个肽链分子含一个Zn离子,其中脯氨酸含量最高,无二硫键,大量比对说明3个组氨酸残基在锌离子结合位点中是保守的His-94,His-96 and His-119。蛋白的N-糖基化位点(211-213aa)被.Met1到Ala18的信号序列所引导,碳酸酐酶基因的研究,为凡纳滨对虾呼吸及渗透调节、体液pH调节、机体钙化等生理活动提供理论依据。 利用实时荧光定量PCR分析了凡纳滨对虾盐度变化下两种CA基因的表达量变化。结果表明,Cac不论在盐度升高还是降低时表达量都显著高于对照组,而Cag只对低盐敏感,在高盐度下表达量没有明显变化。 3三疣梭子蟹两种碳酸酐酶的基因克隆与表达分析 本文克隆了三疣梭子蟹胞质碳酸酐酶基因及磷脂酰肌醇连碳酸酐酶的部分序列。Cac669 Bp cDNA序列,618bp的开放阅读框,编码206个氨基酸;Cag782Bp序列,699bp的开放阅读框,编码233个氨基酸。 组织特异性分析可知,Cac及Cag在鳃丝、肌肉、肝胰脏内有较高表达,在血细胞内和心脏有少量表达。Cac在鳃、肌肉及肝胰脏内表达量均高于Cag。进化树分析可知,三疣梭子蟹Cac与Cag是碳酸酐酶基因超家族的两个亚族,两者均与蟹类亲缘关系最近,与虾类次之,与昆虫同属节肢动物门,而与脊椎动物亲缘关系较远,这说明碳酸酐酶进化中非常保守;另外DNA比对可发现氨基酸比对发现Cag在蛋白的N端比Cac多出一段22个氨基酸的序列,这即为Cag与细胞膜结合的信号肽区域。蛋白结构预测得知,Cac第80-100个氨基酸处为其Zn离子结合位点,Cag第105-120个氨基酸处为其Zn离子结合位点,附近有一个由Val、Leu、Tyr和Leu所构成的疏水口袋和由Thr和Hi s所组成的一个质子转移通道,两种碳酸酐酶均由单一肽链组成,每个肽链分子含一个Zn离子,其中脯氨酸含量最高,无二硫键,第211aa-213aa(Asn-Ser-Ser)为其N一糖基化位点。大量比对说明3个组氨酸残基在锌离子结合位点中是保守的His-94,His-96 and His-119。碳酸酐酶基因的研究,为三疣梭子蟹呼吸及渗透调节、体液pH调节及机体钙化等生理活动提供理论依据。 利用实时荧光定量PCR分析了三疣梭子蟹在盐度变化下两种CA基因的表达量变化。结果表明,Cac不论在盐度升高还是降低时表达量都显著高于对照组,而Cag只对低盐敏感,在高盐度下表达量没有明显变化。
凡纳滨对虾;三疣梭子蟹;水生甲壳动物;渗透调节机制;基因筛选;克隆表达
中国海洋大学
硕士
水生生物学
潘鲁青
2012
中文
S945.46;S968.252
71
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）