海洋微拟球藻microRNA测序鉴定及其转基因体系的建立
microRNA(miRNA)是细胞内源性的、由茎环结构经剪切产生的、长度在～22nt的单链RNA,它通过与靶标mRNA碱基互补配对降解靶标mRNA或抑制翻译过程,参与基因的表达调控。它广泛存在于人、动物、植物和病毒中,与人类疾病、动物生长发育、植物抗逆等过程密切相关。miRNA的研究目前在动植物中较为深入,在单细胞微藻中研究相对较少,仅在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)中有见报道。微拟球藻(Nannoehloropsis oceanica)属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae),微拟球藻属(Nannochloropsis),该藻富含EPA,有望成为EPA生产的原料。此外,该藻油脂含量达到干重的30％以上,可作为能源微藻良好的候选藻种。 本研究以海洋微拟球藻(Nannochloropsis oceanica)为实验材料,通过Solexa高通量测序首次鉴定了该藻中的miRNA,并建立了该藻的遗传转化体系,旨在海洋微拟球藻中实现利用人工设计的miRNA进行基因沉默奠定基础。本研究包括如下二个部分: 第一部分,提取海洋微拟球藻的总RNA,分离其中小于200bp的小RNA,通过在小RNA的两端加上人工接头,构建了小RNA的cDNA文库,应用Solexa高通量测序,获得了数百万条小RNA序列,剔除tRNA、rRNA和可能的mRNA碎片,共获得近2000条疑似miRNA序列,其中76％的序列长度集中在20-22nt。将测得的序列分别与已经报道的和海洋微拟球藻基因组进行比对,发现有37条序列与已经报道的其他物种的miRNA相似性较高,相似度均达90％以上;2条序列与已知同源性较低,但是与已知的两条miRNA的前体序列几乎匹配,且与该藻基因组能够完全匹配,而这2条序列在基因组的上下游序列可形成发夹结构,因此推测这2条序列可能为新的miRNA;1074条序列与已知的miRNA或miRNA的前体序列相似度很低,但与基因组的相应序列可完全匹配,推测这组序列可能是海洋微拟球藻中特异性表达的miRNA。进一步分析表明,测序获得的miRNA的5’端具有对U碱基的偏好性,这一现象与已经报道的其他物种的miRNA相似。 遗传转化体系建立是利用人工设计的miRNA进行基因沉默的平台和基础。本研究第二部分构建了海洋微拟球藻的转基因体系。以pMS188和pCB801为基础质粒,成功构建了同时含有抗性基因ble和多克隆位点的新载体pCJ901,进一步在多克隆位点中插入报告基因eGFP,获得用于转化的重组质粒pCJ901-eGFP。通过电击转化的方法,将重组质粒pCJ901-eGFP转入海洋微拟球藻,成功实现抗性基因和报告基因的表达,说明海洋微拟球藻转基因体系构建成功。 本研究通过Solexa高通量测序首次鉴定了海洋微拟球藻中的miRNA,并通过电击转化法建立了该藻的遗传转化体系,为在海洋微拟球藻中实现利用人工设计的miRNA进行基因沉默奠定了基础。
海洋微拟球藻;microRNA测序;转基因体系;电击转化
中国海洋大学
硕士
动物学
朱葆华;于文功
2012
中文
S968.4;Q949.217
66
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）