大叶藻(Zostera marina L.)愈伤组织体系的建立及优化
本论文以海洋盐生被子植物大叶藻为研究对象,以组织培养技术原理为指导,以大叶藻初生分生组织和器官为外植体,探究培养基种类、培养基添加物、培养方式、培养条件等对大叶藻不同外植体诱导愈伤组织的影响,探讨大叶藻愈伤组织诱导的优化条件,为通过大叶藻愈伤组织诱导体细胞胚间接发生和植株再生提供充足的种质来源,为人工条件下实现大叶藻规模化组织培养快繁体系做基础技术参考;实验结果如下: 1.以大叶藻初生分生组织为外植体诱导愈伤组织 (1)无菌苗的培育及培育条件的优化 本实验研究培养基盐度(5‰、10‰、15‰、20‰、25‰30‰)、培养温度(10℃、14℃、18℃、22℃和26℃)和培养光照强度(0 Lx、500Lx、1000 Lx、2000 Lx和4000 Lx)对大叶藻种子萌发的影响,为组织培养提供充足的无菌外植体来源。 优化实验结果表明,培养液为低盐时(盐度为5‰-10‰)时,有利于大叶藻种子在短时间萌发;而温度为14℃时,种子的萌发率明显高于其他温度下的萌发率;光照强度对大叶藻种子萌发率影响不明显,高光强(4000Lx)不利于种子萌发。 综上所示:培养液盐度为5‰-10‰,在温度为14℃光强为500Lx-1000 Lx时可以为组织培养提供充足的无菌外植体供应。 (2)以无菌苗为外植体进行愈伤组织的诱导 ①培养基种类、培养方式对不同部位的外-植体愈伤组织诱导的影响 本实验研究培养基种类(MS,N6,PESI,VSE和Sea培养基)、培养方式(固体培养、半固体培养和液体培养)对不同部位的外植体(胚根、胚轴和叶)愈伤组织诱导的影响,为大叶藻无菌苗愈伤组织诱导提供基础的理论指导。 实验结果表明:半固体MS,N6,PESI,VSE和Sea培养基不利于无菌苗愈伤组织的诱导,只有液体N6可以促进无菌苗的胚根形成少量浑浊的浅绿色丝状物,染色后发现绿色物质中含有大量细菌或真菌和少量染色浅的空泡状细胞;而五种固体培养基均可以促进无菌苗形成愈伤组织。其中,MS、N6和Sea培养基不利于愈伤组织的形成,愈伤组织诱导率低且含有大量的细菌或真菌:而VSE和PESI培养基有利于无菌苗的胚根形成愈伤组织,组织中含有少量的细胞和极少量的细菌,而叶和胚轴形成的愈伤组织中含有极少量的细胞。 综上所述:无菌苗的胚根可以在添加激素和碳源的固体VSE培养基上形成高诱导率的愈伤组织,组织中含有少量的细胞和极少量的细菌。 ②培养基添加物对大叶藻愈伤组织诱导的影响 本实验研究植物生长调节剂的种类(生长素2,4-D、NAA和IAA与细胞分裂素6-BA和KT配比),植物生长调节剂的浓度(不同浓度的2,4-D和6-BA),碳源种类(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和甘油)、碳源浓度(10 g/L、20 g/L、30g/L、40 g/L和50g/L)和琼脂含量(0％、0.1％、0.4％、0.7％、1.0％和1.3％w/v)对大叶藻愈伤组织形成的影响,以提高愈伤组织的诱导率和愈伤组织的质量。 实验结果表明:VSE培养基中添加2,4-D和6-BA有利于大叶藻无菌苗愈伤组织的诱导,激素浓度对愈伤组织的诱导影响不显著;蔗糖,甘露醇和甘油均有利于大叶藻愈伤组织的诱导,诱导率差异不显著,但是蔗糖有利于外植体形成具有大量染色深细胞的绿色愈伤组织:蔗糖的浓度对大叶藻愈伤组织的形成影响差异不显著,但蔗糖浓度过高(40 g/L-50g/L)时,愈伤组织干瘪无光泽;培养基中添加0.4％-1.3％的琼脂均有利于大叶藻愈伤组织的形成,含量为0.7％时愈伤组织诱导率最高(93.33％),琼脂含量过高(1.0％-1.3％)时愈伤组织干瘪无光泽。 综上所述,培养基中添加2mg/L2,4-D、1mg/L6-BA、30g/L蔗糖和0.7％(w/v)的琼脂有利于形成高诱导率的愈伤组织,且愈伤组织中含有大量染色深的细胞和极少量的细菌。 ③培养条件对大叶藻愈伤组织诱导的影响 本实验研究培养温度(10℃、15℃、20℃、25℃和30℃)和光照强度(500 Lx、1000Lx、2000 Lx、4000 Lx和8000 Lx)对大叶藻愈伤组织形成的影响,以提高愈伤组织的诱导率和愈伤组织的质量。 实验结果表明:培养温度为10℃-30℃时均可以诱导无菌苗的胚根形成愈伤组织,当温度为20℃时,愈伤组织的诱导率最高,为80％,与其他组差异性不显著(P>0.05);高温(25℃-30℃)条件下形成的愈伤组织干瘪无光泽;当培养光照强度为500LX-8000LX时均可以诱导胚根形成愈伤组织;其中当光照强度为500LX时愈伤组织诱导率最高,为86.67％,与其他实验组差异不显著(P>0.05)。光照强度为4000Lx-8000Lx时,愈伤组织干瘪无光泽。 综上所述,当温度为15℃-20℃,光强为500-2000Lx时有利于愈伤组织的形成。 2.以大叶藻器官为外植体诱导愈伤组织 (1)培养基种类、培养方式对不同部位的外植体愈伤组织诱导的影响 本实验研究培养基种类(MS,N6,PESI,VSE和Sea培养基)、培养方式(固体培养、半固体培养和液体培养)对不同部位的外植体(根、地下茎、生殖枝和叶1愈伤组织诱导的影响,为大叶藻愈伤组织诱导提供基础的理论指导。 实验结果表明:大叶藻的根、生殖枝和叶在固体、半固体和液体的MS,N6,PESI、VSE和Sea培养基上培养,没有物质形成。地下茎在固体、半固体和液体Sea培养基中没有明显的变化。在MS和N6固体培养基中,分别有67％和100％的地下茎可以形成愈伤组织,但是经染色鉴定后发现,形成物中只有少量的体积较大的细胞,并且形成了较多的细菌或真菌;而在PESI和VSE固体培养基上既可以形成白色或半透明色的愈伤组织,也可以成细丝,但是组织和细丝均深入到培养基内部,无法取出进行染色实验。有80％外植体在MS液体培养基中形成愈伤组织,染色后发现,组织中有具有少量分枝的丝状体和细胞;在液体N6培养dP,有93％的外植体可以形成大量愈伤组织,染色实验发现,具有大量的细胞,期间夹杂着少量的丝状体形成;VSE培养液不利于外植体形成愈伤组织,愈伤组织含量极少;PESI培养基中,有87％的外植体可形成愈伤组织,染色后发现具有少量体积较大的细胞。 综上所述,大叶藻的地下茎在N6液体培养基中可以形成较高诱导率的愈伤组织,组织中含有大量的染色深的细胞和少量极细的细丝。 (2)消毒剂浓度和消毒时间对获得无菌地下茎外植体的影响 本实验研究不同浓度的次氯酸钠(3％、5％、10％和15％)处理地下茎不同时间(5min、10min和15min)后,对大叶藻无菌外植体获得及愈伤组织诱导的影响,为地下茎组织培养提供大量的、无菌的和可行的外植体 实验结果表明:当次氯酸钠浓度为5％并消毒15min时可以获得60％的无菌外植体;当次氯酸钠浓度为10％并消毒5min-15min时可以获得60％以上的无菌外植体,其中消毒10min时,不但可以获得高达80％的无菌外植体并且这些外植体均可以形成大量的愈伤组织。 综上所述,当次氯酸浓度为10min时,可以获得高达80％的无菌外植体,足以为组织培养提供充足的、可行的无菌外植体。 (3)外植体取材大小对地下茎愈伤组织诱导的影响 本实验研究不同大小的外植体(一茎节、二茎节和三茎节)对地下茎愈伤组织愈伤组织诱导的影响,探究地下茎组织培养的最适打下外植体长度,既节省自然外植体资源,又可以形成大量的愈伤组织。 实验结果表明:当外植体为二茎节或三茎节时,外植体上没有任何物质生成,但,培养基呈淡粉色,取培养液染色,可以发现具有大量染色稍浅且体积稍小的细胞。而外植体为一茎节时,外植体整个表面形成大量白色团块物质,染色后发现,具有大量的细胞,很多细胞连在一起,成丝状。 综上所述,当地下茎为一茎节长度时最有利于地下茎愈伤组织的形成。 (4)培养基添加物对大叶藻愈伤组织诱导的影响 本实验研究植物生长调节剂的种类(生长素2,4-D、NAA和IAA与细胞分裂素6-BA和KT配比),植物生长调节剂的浓度(不同浓度的2,4-D和6-BA),碳源种类(蔗糖、葡萄糖、甘露醇和甘油)和蔗糖浓度(10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50g/L)对大叶藻地下茎愈伤组织形成的影响,以提高愈伤组织的诱导率和愈伤组织的质量。 实验结果表明:所有激素配比均可以促进地下茎形成愈伤组织,愈伤组织大量繁殖可以形成愈伤组织球(NAA+6-BA除外),其中2,4-D和6-BA最有利于愈伤组织的形成,所有配比中均可以形成大量染色深的丝状体;低浓度和高浓度的激素处理下形成的愈伤组织中含有直径较细的丝状体;培养基中添加蔗糖、甘油和甘露醇均有利于愈伤组织的形成,但是甘油和甘露醇处理组的产物中含有大量的污染物;培养基中添加10-50g/L的蔗糖均能诱导大叶藻地下茎形成愈伤组织,差异不显著,当培养基中蔗糖浓度为10-20g/L时,形成物中有大量染色极浅的细胞,而蔗糖浓度为40-50g/L时,愈伤组织中存在少量染色深的丝状体和大量的细菌,蔗糖浓度为30g/L时,形成物中有大量染色深的丝状体。 综上所述,培养基中添加2mg/L2,4-D、1 mg/L6-BA和30g/L蔗糖有利于形成高诱导率的愈伤组织,且愈伤组织中含有大量染色深的丝状体和极少量的细菌。 (5)培乔条件对大叶藻地下茎愈伤组织诱导的影响 本实验研究培养温度(10℃、15℃、20℃、25℃和30℃)、光照强度(500 Lx、1000Lx、2000 Lx、4000 Lx和8000 Lx)以及摇床培养的振荡速度(0rpm、80 rpm、120 rpm和160rpm)对大叶藻地下茎愈伤组织形成的影响,以提高愈伤组织的诱导率和愈伤组织的质量。 实验结果表明:当温度为15％-20℃时有利于地下茎愈伤组织的形成,其中温度为15℃时最有利于地下茎进行愈伤组织的诱导,愈伤组织诱导率最高且丝状体直径较粗,低温(10℃)形成的愈伤组织中丝状体直径较细,而高温(25℃和30℃)形成的愈伤组织中有大量的细菌;光照强度对地下茎愈伤组织的形成影响不明显,高光强(4000 Lx-8000Lx)时愈伤组织中含有大量的细菌;振荡速度为120pm时有利于地下茎愈伤组织的诱导。 综上所述,温度为15℃-20℃,光强为500Lx-2000Lx,振荡速度为120rpm时,有利于地下茎形成细菌极少的直径较粗的丝状体。
大叶藻;愈伤组织;植株再生;植物生长调节剂
中国海洋大学
硕士
水产养殖
宫庆礼
2012
中文
Q949.2
120
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）