不同分子质量海带苔藻聚糖硫酸酯抗血栓活性及机理研究
岩藻聚糖硫酸酯是一种富含硫酸基团的阴离子多糖,主要来源于褐藻、海参和海胆等。因其具有抗凝血、抗病毒、抗肿瘤、抑制血管增殖以及抗氧化等多种生物学活性,成为当今海洋功能性食品和药物研究的热点。 体外研究表明,不同来源的大分子岩藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓活性。但由于这些大分子岩藻聚糖硫酸酯一般分子组成复杂,溶解性低,吸收较差。若直接注射又会产生较大的毒性,进入体内后副作用较大,限制了其应用。 近年来,有报道称从泡叶藻中提取的低分子质量岩藻聚糖硫酸酯在体内同样显示出抗血栓活性。由于提取来源不同,岩藻聚糖硫酸酯的化学组分和结构会有较大差异,对于从海带中提取的低分子质量的岩藻聚糖硫酸酯是否同样具有抗血栓活性,还鲜有报道,亦未见对其抗血栓机制进行研究的相关报道。 本课题组前期应用自由基氧化法和阴离子交换法,从海带中制备纯化了具有不同分子质量和硫酸根含量的4种岩藻聚糖硫酸酯组分,分别为低分子质量的岩藻聚糖硫酸酯LF1和LF2,中分子质量的MFa和MFb。本文对这4种岩藻聚糖硫酸酯进行了抗血栓活性以及相关机理的研究,主要工作及结论如下: 1.对不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯的体内抗血栓活性进行了研究 首先对不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯进行急性毒性研究,并结合前期预实验得到的药效学结果,确定合理的给药剂量。在此基础上,采用Fecl3刺激法制作动脉血栓模型,采用结扎法制作下腔静脉血栓模型,对不同分子质量和硫酸根含量的岩藻聚糖硫酸酯体内抗血栓活性进行全面评价。 通过急性毒性实验发现,随着分子质量的增加,其毒性逐渐增强。其中2种LMWF的LD50相近(分别为716.0mg·kg-1和639.1 mg·kg-1),而2种MMWF的LD50相近(分别为50.6 mg·kg-1和45.1 mg·kg-1)。 在本实验中,4种岩藻聚糖硫酸酯均具有良好的抗血栓作用。且随着分子质量增加,其血栓湿重逐渐减少,血栓生成抑制率逐渐增加,说明其抗血栓作用逐渐增强。并且这种抗血栓活性呈现明显的剂量相关性。 2.对不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯的内皮保护作用及其机制进行了研究。 同时采用体内研究和体外研究的方法,探讨了不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞的保护作用。在体内研究中,通过制作大鼠内皮损伤模型,显微镜下观察大鼠胸主动脉内皮损伤情况,并测定内皮损伤指标血管性血友病因子(vWF)。在体外研究中,通过细胞培养,考察药物对内皮损伤的保护作用,除vWF外,本文还使用内皮微颗粒(EMPs)水平作为内皮损伤指标。 在本文中,我们发现低分子质量的岩藻聚糖硫酸酯对内皮细胞均具有良好的保护作用;而中分子质量的岩藻聚糖硫酸酯虽然对内皮细胞的损伤有所改善,但这种保护作用远远低于LMWF。同时发现,LMWF可通过降低vWF和EMPs浓度,阻断血小板与受损血管内皮中的胶原结合,从而抑制了血小板活化,发挥内皮保护作用。 3.考察了不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对血小板系统的影响及其作用机制 通过制作大鼠血管内皮损伤模型,考察了海带岩藻聚糖硫酸酯对血小板粘附率的影响;应用二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和血小板活化因子(PAF)3种诱导剂考察了海带岩藻聚糖硫酸酯对血小板聚集率的影响;检测了影响血小板聚集的重要指标TXB2和6-Keto-PGF1α和对胞浆Ca2+内流的影响。 结果显示,低分子质量的LF1和LF2均可明显降低血小板粘附率,而中分子质量的MFa和MFb对血小板粘附率没有明显影响。LF1和LF2对由ADP、AA和PAF诱导的血小板聚集均具有较好的抑制作用,而中分子质量的MFa和MFb对血小板聚集不仅没有抑制作用,反而表现出促进血小板聚集的作用。4组岩藻聚糖硫酸酯均表现出降低TXB2的作用,其中LF1和LF2组的降低作用强于MFa和MFb;另外,LF1和LF2同时具有升高6-keto-PGF1α的作用,而MFa和MFb则与模型组比较无统计学差异。此外,LMWF会对PAF诱导产生的Ca2+内流起到显著的抑制作用,而MMWF则没有这种抑制作用。 研究结果表明,LMWF可通过抑制血小板的粘附和聚集,发挥抗血栓作用;而MMWF对血小板功能影响很小,其抗血栓作用更依赖于其他途径。进一步发现,LMWF抑制血小板活化的具体作用机制是通过降低TXB2和升高6-Keto-PGF1α水平,以及抑制胞外Ca2+内流来实现的。 4.对不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯的抗凝活性和相关机制进行了研究以抗血栓活性实验中确定的岩藻聚糖硫酸酯剂量为基础,通过体内研究,首先对不同分子质量岩藻聚糖硫酸酯的抗凝血活性进行了比较。并通过出血实验,考察了不同分子质量的海带岩藻聚糖硫酸酯作为抗栓候选药的安全性。最后,通过对调节凝血过程的几种关键物质TFPI、AT-Ⅲ、PC和FIB进行检测,对其抗凝血机理进行了深入探讨。 结果显示,海带岩藻聚糖硫酸酯的抗凝活性呈现明显的剂量依赖性,并且抗凝活性随着分子质量的增加而增加。此外,出血实验显示,随着海带岩藻聚糖硫酸酯的分子质量增加,出血危险性也增加。 研究结果表明,不同分子质量的岩藻聚糖硫酸酯,发挥抗凝作用的机制也不同。对于LMWF而言,主要通过提高TFPI活性发挥作用;而MMWF除可通过TFPI途径发挥抗凝作用外,当达到一定浓度时,会通过影响纤维蛋白原浓度发挥抗凝血作用。 5.考察了不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对纤溶系统的影响及其作用机制首先通过体内研究,考察岩藻聚糖硫酸酯对全血凝块溶解实验、优球蛋白溶解时间两个纤溶指标,对不同分子质量的海带岩藻聚糖硫酸酯纤溶活性进行了比较。并通过大鼠动脉血栓模型和静脉血栓模型,考察了调节体内纤溶系统的关键指标尿激酶型纤溶酶原活化剂(u-PA)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)等,以确定具体的作用机理。 结果显示,海带岩藻聚糖硫酸酯的纤溶活性随着分子质量的增加而逐渐增强。同时,纤溶活性的强弱也呈现出一定的剂量相关性。说明对岩藻聚糖硫酸酯可通过激活纤溶酶原转换为纤溶酶发挥溶栓作用。从结果中还可以看出,其对纤溶酶原的激活主要是通过增强t-PA活性和抑制PAI-1活性来实现的。对u-PA活性并无影响。 6.考察了不同分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯对血液流变学的影响 通过制作大鼠血瘀模型,考察了岩藻聚糖硫酸酯对全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞沉降率等血液流变学参数的影响。 结果显示,LMWF对各项血液流变学指标均没有改变,而MMWF可明显降低全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞沉降率及血沉方程K值等指标,提示通过改善血液流变学指标,可能是MMWF发挥抗血栓作用的一个重要途径。 通过本文的研究,我们证实了海带中提取的不同分子质量的岩藻聚糖硫酸酯同时具有抗凝血和溶栓的功能,还可通过抑制血小板活化而发挥良好的内皮保护作用,这是目前临床所使用的抗血栓药所不具备的,因此具有良好的开发前景。 另外我们也发现,海带岩藻聚糖硫酸酯发挥抗血栓作用的的途径随着分子质量的不同会发生改变,对于低分子质量的海带岩藻聚糖硫酸酯主要是通过抗凝血、抗血小板活化和纤溶功能发挥抗血栓作用;而对于中分子质量海带岩藻聚糖硫酸酯来说,主要通过抗凝血、纤溶作用和改善血液流变学来发挥抗血栓作用。 通过本文的研究发现,对于同一种生物功能,其作用强弱甚至是作用机制也会随着分子质量的改变而发生改变。如LMWF与MMWF均具有抗凝血和纤溶作用,但这两种作用都随着海带岩藻聚糖硫酸酯分子质量的增加而增强。同时,虽然不同分子质量岩藻聚糖硫酸酯都具有抗凝血功能,但LMWF主要通过提高TFPI活性发挥作用;而MMWF除可通过TFPI途径发挥抗凝作用外,当达到一定浓度时,会通过影响纤维蛋白原浓度发挥抗凝血作用。 通过本文的研究,我们全面考察了海带中提取的不同分子质量岩藻聚糖硫酸酯的体内抗血栓活性,并对其抗血栓机理进行了系统研究。为其下一步作为抗血栓候选药进入临床研究提供了坚实的理论基础和数据支持。
岩藻聚糖硫酸酯;海带;抗血栓活性;作用机理
中国海洋大学
博士
生药学
于文功
2012
中文
R284;R285.5
139
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）