一种海洋真菌来源蒽环类化合物灰绿霉素A抗肿瘤作用的早期成药性研究
来源于微生物代谢产物的抗肿瘤抗生素一直以来是抗肿瘤药物的杰出代表,其中以阿霉素(Doxorcubicin)及其衍生物为代表的葸环类抗肿瘤药物在临床上主要用于治疗实体瘤、白血病等。但是该类药物累积心脏毒性等多种毒副作用限制了其治疗作用,因此降低毒副作用而保留其抗肿瘤活性一直是这类化合物研究开发的热点。灰绿霉素A(Aspergiolide A,ASP-A)是从海洋红树林根部海泥的真菌灰绿曲霉Aspergillus glaucusHB1-19中提取获得的一个结构新颖的具有自主知识产权的葸环内酯类化合物。 本文主要对ASP-A抗肿瘤成药性进行了早期评价,具体包括以下几个方面:1、ASP-A抗肿瘤药效学研究;2、ASP-AHPLC检测方法的建立及药代动力学研究;3、小鼠组织中ASP-A分布情况评价;4、体外早期吸收评价;5、早期安全性评价。 一、AS-.A抗肿瘤药效学研究(1)MTT法检测ASP-A对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用。结果表明ASP-A对Hela、SMMC-7721、SGC-7901等细胞有不同程度的增殖抑制作用,在上述细胞株上作用的IC50值在2～7.07μM浓度范围内,说明ASP-A在体外具有广谱的抗肿瘤细胞增殖活性。(2)蛋白印迹法(Western Blotting)检测不同浓度ASP-A(2.5μM、5μM、10μM)对人肝癌细胞BEL-7402中凋亡相关蛋白的影响。BEL-7402经ASP-A作用12h后,细胞中与凋亡相关的蛋白Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8、PARP等出现剪切条带,促凋亡蛋白Bax与凋亡抑制蛋白BCL-2比值升高,DNA断裂标志性蛋白γ-H2Ax表达量增多。提示ASP-A能够引起细胞DNA断裂,并有促细胞凋亡的作用。(3)在小鼠肝癌模型中,设置了空白组、溶剂组、ASP-A高、中、低三个剂量组(45mg/kg,15mg/kg,5mg/kg)、阿霉素组(2mg/kg),腹腔注射,每天给药,连续给药8天。实验结果显示ASP-A高、中、低三个剂量的抑瘤率分别是66％、72％及55.4％,说明ASP-A可以明显抑制H22移植瘤的生长,有很好的抗肿瘤活性,且对小鼠体重的影响较小。(4)在人肝癌裸鼠移植瘤模型上,ASP-A的给药浓度分别是28mg/kg,14mg/kg,7mg/kg,腹腔注射连续给药21天。结果显示ASP-A高、中、低三个浓度对BEL-7402移植瘤的抑制率分别是51.2％、48.8％和40.1％,对裸小鼠的体重影响轻微。 二、ASP-A临床前药代动力学、早期安全性等研究 (1)建立ASP-AHPLC检测方法,采用内标法定量,经方法学验证,该方法的专属性、准确度、精密度和定量线性范围均符合新药成药性评价相关规范的要求。 (2)荷瘤小鼠腹腔注射ASP-A两个剂量(15mg/kg和30mg/kg)后分别于不同时间点采血取样,经HPLC检测,3P97软件计算得到相关的药代动力学参数。结果显示,ASP-A在小鼠体内呈二房室模型代谢。两种浓度下(15mg/kg和30mg/kg)得到的药代动力学参数分别是:t1/2β(min):42.70,47.61;T peak(min):15.33,15.88;Cmax(mg·L-1):20.96,39.50;CL(L·kg-1·min-1):0.011,0.012;AUC(mg·min·L-1):1359.41,2493.94。 (3)荷瘤小鼠腹腔注射ASP-A两个剂量(15mg/kg和30mg/kg),分别在给药后15min、30min和60min摘取各组织,经HPLC分析,评价ASP-A在小鼠组织中的分布。实验结果表明ASP-A主要分布在心脏、肾脏和肝脏中。 (4)ASP-A在小鼠体内最大给药量为400mg/kg,该剂量远大于体内有效剂量,说明ASP-A在有效剂量下是安全可靠的。小鼠微核实验结果显示,ASP-A最大给药剂量组的微核率与阴性对照组没有显著性差异,表明ASP-A无明显的致突变作用。 (5)手动膜片钳技术检测ASP-A对hERG通道的抑制作用。ASP-A的检测浓度为1.25μM,2.5μM,5μM和10μM,对hERG电流的抑制率分别为0.9±1.6％,2.0±2.3％,3.8±4.0％和10.1±5.9％,该结果表明ASP-A对心脏hERG通道没有明显的抑制作用。 (6)Caco-2单层模型评价ASP-A的体外吸收方式。本文建立的Caco-2细胞单层模型符合相关标准规定。ASP-A在Caco-2单层模型上的摄取呈剂量和时间依赖性,且ASP-A在该模型上的转运是主动转运过程。
海洋真菌;灰绿霉素;抗肿瘤作用;成药性
中国海洋大学
硕士
制药工程
李静
2012
中文
R282.77;R979.1
70
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）