牙鲆淋巴囊肿病毒细胞受体的鉴定与特性分析
鱼类淋巴囊肿病(lymphocystis disease，LCD)是由淋巴囊肿病毒(lymphocystisdisease virus，LCDV)引起的一种典型的皮肤和浅表组织慢性病毒性疾病，已知可感染至少42科140种以上的海水、半咸水和淡水鱼类，尤其在我国养殖的牙鲆中流行较为广泛。有报道表明淋巴囊肿病毒可能通过细胞吞噬和受体介导作用进入宿主细胞。通过封闭细胞受体从而阻断病毒入侵是防治病毒病的一个有效途径。因此，本文旨在通过分离鉴定牙鲆淋巴囊肿病毒受体，促进对淋巴囊肿病毒侵染机制及其在宿主体内传播途径的认识，将对防治淋巴囊肿病有重要意义。
本文利用免疫共沉淀技术和病毒铺覆蛋白印迹技术(VOPBA)对牙鲆淋巴囊肿病毒的细胞受体进行分离与鉴定，并用双向电泳、质谱分析及生化方法等对受体蛋白的特性进行分析；制备了病毒受体的单克隆抗体；通过病毒阻断实验确定了淋巴囊肿病毒的细胞受体，并利用所制备的受体单抗研究了病毒受体蛋白在牙鲆各组织中的分布情况。具体结果如下：
(1)LCDV及其敏感细胞系牙鲆鳃细胞(Flounder gill cell line，FG)是本文研究LCDV细胞受体的两大关键材料。通过差速离心和蔗糖密度梯度离心得到了LCDV病毒粒子，形态完整，纯度较高；FG细胞用含10％胎牛血清的Eagle’s MEM培养基在22℃、2％CO2条件下培养，生长迅速，状态良好。高纯度的LCDV与生长良好的FG细胞为后续研究打下坚实的基础。
(2)首先利用NP-40和差速离心抽提出FG细胞膜蛋白，并通过免疫共沉淀法用抗LCDV单克隆抗体和LCDV从FG细胞膜蛋白中沉淀下一个分子量为27.8 kDa的LCDV受体蛋白。对该受体蛋白进行质谱分析，结果表明27.8kDa受体蛋白与β-actin蛋白有较强的相关性；利用切胶回收方法提纯该受体蛋白，制备了其多抗，Western blotting显示该多抗主要与FG细胞膜蛋白中的27.8kDa蛋白结合，但也与42.7kDa蛋白微弱结合；用抗β-actin抗体与FG细胞膜蛋白反应，发现其中42.7 kDa蛋白有较强反应，而27.8 kDa蛋白有较弱反应。因β-actin在不同的物种间高度保守，其分子量大小为42-43 kDa左右，故推测27.8 kDa蛋白可能是β-actin蛋白的一部分或是一种与β-actin蛋白有某些相似结构域的未知蛋白。
(3)利用提纯的27.8 kDa受体蛋白免疫Balb/c小鼠，采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、克隆等，得到了2株单克隆抗体(2G11和3D9)。Westernblotting分析显示这2株单抗均可与FG细胞膜上的27.8 kDa蛋白结合，且与其他蛋白无交叉反应。利用2株单抗进行共聚焦免疫荧光和胶体金免疫电镜研究，结果显示FG细胞上与单抗特异性结合的阳性信号主要分布在细胞膜表面，呈点状或线状不连续分布，证实27.8 kDa蛋白主要位于细胞膜上。阻断EHSA实验发现单抗2G11和3D9均可部分阻断LCDV与FG细胞膜蛋白的结合，阻断率分别为83.6％和79.4％；病毒体外感染阻断实验结果显示，单抗2G11和3D9可以有效阻断LCDV对FG细胞的感染。
(4)采用非变性VOPBA在FG细胞上分离出135 kDa受体蛋白，经SDS-PAGE与双向电泳发现135 kDa蛋白由58.3 kDa、44.6 kDa及37.6 kDa三个蛋白组成，其中起病毒结合活性为37.6 kDa蛋白。采用免疫共沉淀联合VOPBA的方法分析27.8 kDa和37.6 kDa蛋白的关系，结果发现在免疫共沉淀中，虽然仅出现27.8kDa蛋白，未出现37.6kDa蛋白，但在用免疫共沉淀结果进行VOPBA时显示出了37.6kDa蛋白，但未出现27.8kDa蛋白，说明FG细胞膜上的27.8kDa蛋白与37.6kDa蛋白均为LCDV的受体蛋白，其中27.8kDa蛋白仅在天然状态下具有病毒结合能力，且在细胞内含量较高；而37.6kDa蛋白的病毒结合能力与其蛋白的二级结构无关，但其在细胞内含量较低。
(5)利用免疫共沉淀方法对牙鲆鳃、胃、肠和表皮组织上的LCDV受体蛋白进行分离，发现牙鲆鳃、胃与肠组织蛋白中均有一个分子量为27.8 kDa的蛋白能与LCDV特异结合，而表皮中LCDV结合蛋白分子量为37.6 kDa。通过能够特异性显示糖蛋白的阿尔新蓝染色法对该免疫共沉淀结果进行染色，发现鳃、胃与肠中的27.8 kDa蛋白为非糖蛋白，而表皮中的37.6 kDa蛋白为糖蛋白。用Western blotting分析抗27.8 kDa蛋白单抗与牙鲆各组织蛋白的结合情况，结果显示该单抗可与牙鲆鳃、胃、肠、肝组织上的27.8 kDa蛋白反应，但与表皮、肾和脾组织上的蛋白均无反应。
牙鲆;淋巴囊肿病毒;细胞受体;病毒感染阻断;受体单克隆抗体
中国海洋大学
博士
水产养殖
战文斌;绳秀珍
2012
中文
S917.4
108
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）