半滑舌鳎(Cynoglossu semilaevis)两种抗菌肽和细胞因子Midkine的克隆与表达分析
本研究以实验室已构建的半滑舌鳎cDNA文库为基础，利用RACE技术、染色体步移等技术筛选出半滑舌鳎两种抗菌肽hepcidin、NK-lysin以及一种细胞因子Midkine基因全长，并通过研究这三个基因的序列，基因结构，正常组织、发育时期和免疫刺激下的表达情况，体外表达及活性检测等方面，为进一步研究奠定基础，现将主要研究结果分述如下：
半滑舌鳎CsHepcidin cDNA序列由171 bp5’-UTR，291 bp ORF和151 bp3’-UTR组成，预计编码96个氨基酸残基的前体，该前体由信号肽，前体肽和成熟肽组成，成熟肽具有保守的8个半胱氨酸残基。hepcidin基因全长由3个外显子和2个内含子组成，内含子2存在一个三碱基ACA重复的微卫星。序列、基因组结构和进化分析均表明CsHepcidin是鱼类hepcidin1家族成员。荧光定量PCR显示CsHepcidin在各组织中均有不同程度的表达，其中在肝脏和脑中表达量较高，而在胚胎和仔鱼发育过程中，孵化后6 d CsHepcidin显著增加，而在变态期则明显降低，暗示CsHepcidin的表达受半滑舌鳎胚胎发育的调节，并可能参与半滑舌鳎变态期发生的复杂的生理生化过程。鳗弧菌免疫刺激后，CsHepcidin在肝脏、脾脏和头肾中的表达都有显著增加，表明CsHepcidin可能在半滑舌鳎对外界刺激和病原生物侵袭的防御过程中有不可忽视的作用。为研究CsHepcidin的抗菌活性，本研究成功构建了原核表达载体pET32a(+)-HEP，并转化进宿主菌BL21(DE3)pLysS，成功诱导表达可溶性的重组蛋白HEP，纯化的重组蛋白对多种菌株的生长都有不同程度的抑制作用，尤其是对海洋致病菌鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌等效果比较明显，而对革兰氏阳性菌株金黄色葡萄球菌的抗菌能力则较弱。
半滑舌鳎抗菌肽NK-lysin基因全长1516 bp，由5个外显子和4个内含子组成，其cDNA序列全长683 bp，包括5’-UTR47 bp，ORF408 bp和3’-UTR228 bp，预计编码135个氨基酸残基组成的分泌性蛋白，成熟肽具有6个保守的半胱氨酸残基以及一个SAPLIP家族典型特征的Saposin B结构域。同源性分析表明CsNK-lysin与牙鲆、大西洋鲑的一致性较高，而与牛、马、猪和鸡的NK-lysin则很低。CsNK-lysin保守的蛋白结构、序列特征和相似的三级结构暗示CsNK-lysin可与入侵病原菌相互作用，并显示抗菌活性。本研究中发现由于内含子4的不正常剪切，半滑舌鳎中CsNK-lysin存在三种剪切型，三者的C端序列存在几个氨基酸残基的差异。荧光定量PCR显示CsNK-lysin三种剪切型的组织表达具有一定相似性，均在小肠和心脏中表达水平较高。鳗弧菌免疫刺激后，CsNK-lysin三种剪切型在小肠、脾脏和头肾中的表达呈现不同模式，表明CsNK-lysin可能参与半滑舌鳎的非特异性免疫过程，但具体的调控机理尚不明确。
半滑舌鳎细胞因子Midkine基因全长3541 bp，由5个外显子和4个内含子组成。CsMidkine cDNA序列全长1098 bp，包括5’-UTR159 bp，3’-UTR504 bp以及ORF435bp，预计编码144个氨基酸残基组成的分泌性蛋白，成熟肽富含半胱氨酸和碱性氨基酸，具有典型的Pleiotrophin/Midkine家族的结构特征。CsMidkine基因的5’侧翼邻接甘油二酯激酶基因，并存在视黄酸受体结合位点、类固醇/甲状腺激素受体结合位点、Sp1、GATA-1、Mef，C/EBP等多种潜在的转录因子结合位点。荧光定量PCR显示CsMidkine在成鱼脑组织中特异性表达，而在半滑舌鳎胚胎发育过程中，CsMidkine表达量在原肠胚中期开始显著增加，在神经胚和脑部分化时期其表达都有显著变化。整体原位杂交显示CsMidkine主要集中在胚胎头部表达，在未来的间脑、中后脑边界(MHB)和后脑一直存在高强度的杂交信号，个别区域信号变化，如神经管。从表达时间、表达分布结合系统进化树综合分析，推测半滑舌鳎CsMidkine属于MKb分支，参与半滑舌鳎脑部的发育和分化过程。利用SOEing PCR法对半滑舌鳎Midkine成熟肽进行定点突变，并利用原核表达体系对其进行了重组蛋白的诱导表达，重组蛋白主要以可溶形式存在于上清中。在鲆鲽鱼类中诱导表达可溶性的重组Midkine成熟肽，为进一步研究半滑舌鳎Midkine的结构和功能奠定基础。
半滑舌鳎;抗菌肽;细胞因子;荧光定量;整体原位杂交
中国海洋大学
博士
遗传学
张全启
2012
中文
Q78
124
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）