泥蚶高通量转录组分析及生长相关基因的克隆与表达研究
泥蚶(Tegillarca granosa)俗称血蚶，是江、浙、闽沿海居民喜食的海鲜佳品，是我国传统四大养殖贝类之一，也是我国滩涂贝类养殖的主要对象。近年来，随着泥蚶人工育苗技术的突破和规模化养殖技术的成熟，泥蚶养殖业呈快速发展趋势，产生了巨大的经济效益和社会效益。然而，与之不相适宜的是，目前泥蚶分子遗传基础薄弱、基因组序列信息匮乏、遗传育种工作刚刚起步，严重影响功能基因开发的进程和分子育种实践的开展。为此，本研究利用新一代高通量454测序技术对泥蚶不同组织器官和不同发育阶段样品进行转录组测序，通过对高质量序列的拼接组装和基因注释，发掘与生长、营养代谢、繁殖、抗病等主要经济性状相关的候选基因，为后续开展功能基因研究和分子育种实践提供有价值信息；利用RACE和RT-PCR技术，对泥蚶生长调控基因Smad3、BMP7、ERK2、GRB2和蛋白质代谢基因LAP3进行基因克隆和表达分析，研究它们与生长的密切关系，筛选可作泥蚶良种选育的候选基因；从泥蚶转录组中批量开发和验证SSR分子标记，为群体遗传分析、遗传连锁图谱构建、生长性状主效QTLs的精确定位等研究提供有力工具。主要结果和结论如下：
1.基于454 GS FLX高通量测序的泥蚶转录组分析
应用454高通量测序技术，对泥蚶4个组织和3个发育阶段样品进行了转录组测序，获得了1170337条高质量序列，通过序列拼接得到17940个重叠群(isotig)和131980个单拷贝序列(singleton)，isotig平均长度达到934bp，测序深度为5.6倍。对泥蚶拼接得到的isotig与Swiss-prot、Nr等公共蛋白质数据库比对，通过GO注释对基因进行分类，KEGG注释了解基因间的联系和生物体的生化代谢网络。从注释的基因中鉴别出大量调控泥蚶肌肉、上皮、神经、纤维等的生长因子及受体，找到了与生长相关的TGFβ信号通路、MAPK信号通路中的多个重要基因；查找到大量与生长、发育、繁殖和免疫等生产相关的候选基因，为后续开展功能基因研究和分子育种实践有重要价值。在泥蚶转录组中，发现血红素合成过程中的大部分关键酶，推瓣贝类血红蛋白合成的基本过程可能与脊椎动物十分相似。另外，从泥蚶转录组中检测到6338个SSR和20038个SNP候选标记，为分子标记的大规模开发提供了重要资源。
2.利用泥蚶转录组序列大量开发微卫星标记，并研究其引物在毛蚶中的通用性
EST文库筛查法是目前大量开发微卫星标记的重要方法，具有方法简便、花费低廉等优点。本研究从泥蚶454转录组测序得到的大量isotig和singleton序列中搜索到6338个SSR位点，可用于大规模开发SSR标记。在3828条isotig序列里，共检测到138条适合设计引物的序列，扩增得到81个稳定扩增的位点，这些位点在泥蚶奉化群体中进行多态性检测，共扩增出242个等位基因，各位点的等位基因数为2～9个，平均每个位点产生3.90个等位基因，观测杂合度为0.040～1.000，期望杂合度为0.040～0.844，多态信息含量为0.038～0.806。33个SSR来自注释基因序列，对这些基因的准确定位有很大帮助。用62对泥蚶多态性SSR引物在毛蚶中进行了通用性验证，结果有22对成功扩增，16对表现为多态，这些多态位点可作为毛蚶和泥蚶的通用性标记。
3.泥蚶Smad3基因的克隆与表达分析
Smad3是TGF-β通路的重要成员，可将信号分子从细胞表面受体传导至细胞核，是重要的生长调控因子。利用RACE技术扩增得到泥蚶Smad3基因2341bp的cDNA全长，编码423个氨基酸。蛋白质功能域分析表明，Tg-Smad3含有两个保守功能域MH1和MH2。氨基酸序列比对发现，它与脊椎动物的同源性达到80％以上，说明Tg-Smad3氨基酸序列十分保守。RT-PCR结果表明，Tg-Smad3在泥蚶各成体组织都有表达，其中足和血液中表达量最高，可能与细胞增殖和免疫过程有关；在早期发育阶段，Tg-Smad3的表达量呈逐渐升高的趋势，在D形幼虫时期表达量最高，推测其参与贝壳的形成过程。
4.泥蚶BMP7基因的克隆与表达分析
BMP7也是TGF-β通路中的重要成员，在生物体内具有重要且广泛的生物功能，参与骨骼的生长、代谢，调节细胞的分化、增殖和凋亡，并在生殖系统的生长、发育中发挥重要作用。本研究克隆得到Tg-BMP7基因的cDNA全长，开放阅读框为1275bp，编码425个氨基酸。功能域预测表明，Tg-BMP7是一个糖蛋白，包含由29个氨基酸组成的信号肽，3个二硫键，并有一个TGF-β家族信号。RT-PCR结果显示，Tg-BMP7在成贝外套膜和鳃中表达量高；在早期发育阶段中，D形幼虫的表达量显著高于原肠胚、担轮幼虫和幼贝，推测Tg-BMP7可能参与贝壳的形成过程，并具有组织分化、调控胚胎生长发育等生理功能。
5.泥蚶ERK2基因的克隆与表达分析
ERK2是MAPK家族重要的反应激酶系统，主要参与调控细胞生长、分化和细胞周期调控等生理功能。泥蚶ERK2基因cDNA全长1673bp，编码359个氨基酸，功能域预测找到一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性区域，这是ERK家族蛋白的特征性区域。氨基酸序列比对和系统进化分析发现，Tg-ERK2蛋白与脊椎动物的同源性达到80％以上，说明该基因十分保守，可能功能与脊椎动物有类似之处。RT-PCR结果表明，Tg-ERK2在泥蚶各组织、各个发育阶段都有表达，说明Tg-ERK2功能强大，参与到多种生命活动中去；相对而言，Tg-ERK2在泥蚶成体的血液中表达量最高；而在早期发育阶段中表达量逐渐升高，D形幼虫期达到最高，这可能与此期细胞分化加剧、神经细胞形成较多有关。
6.泥蚶GRB2基因的克隆与表达分析
GRB2蛋白是一个重要的接头分子，参与细胞内各种受体激活后的下游调节，调控细胞的增殖和分化。Tg-GRB2基因全长1275bp，编码236个氨基酸。Tg-GRB2蛋白包含3个功能域，1个SH2和2个SH3，这是GRB2发挥生理功能的活性区域。Tg-GRB2在泥蚶不同组织中的表达量由大到小依次为：血液>足>鳃>外套膜>闭壳肌>内脏团；在早期发育阶段中，GRB2基因在原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量，原因可能是随着胚胎发育过程的进行，细胞分裂速度加快，生命活动旺盛，信号传导需要较多的接头蛋白
7.泥蚶蛋白质代谢基因LAP3的克隆与表达分析
LAP3是M17类蛋白家族的一员，在细胞成熟、细胞生长、调节损伤防御、维持细胞动态平衡方面发挥重要作用。Tg-LAP3基因全长为1590bp，编码530个氨基酸，包括Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域(41-174 bp)和Peptidase_M17催化结构域(209-522 bp)，缺失HEXXH锌结合体motif，充分证明了该蛋白为LAP3蛋白。RT-PCR结果表明，Tg-LAP3在足中表达量最高，而在早期发育阶段中表达量逐渐升高，D形幼虫期达到最高，在幼贝中表达量最低。
泥蚶;转录组;454高通量测序;生长性状;功能基因;基因克隆;时空表达
中国海洋大学
博士
遗传学
包振民
2012
中文
Q75;S917.4
162
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）