海洋解脂耶罗威亚酵母菌产柠檬酸的研究
柠檬酸是一种重要的有机酸，在制药业、食品业及化妆业等具有极多的用途，并对人体健康有一定的益处。工业柠檬酸主要是玉米、红薯等粮食作物通过发酵方式获得的。近年来世界粮食短缺，价格飞涨，使柠檬酸产品的低价优势不断减小。木薯淀粉和菊粉是新型工业非粮食原料，其水解产物分别为葡萄糖和果糖，是生产柠檬酸的良好碳源，将这2种非粮食原料运用于柠檬酸的工业生产，在降低成本、节约粮食资源和粮食安全等方面具有良好的应用前景。
目前，柠檬酸的工业生产菌株主要是黑曲霉(Aspergillus niger)，但该菌发酵产酸易引起环境污染且其菌体结构不利于遗传改造。产酸酵母菌解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)能弥补黑曲霉产酸的不足，因而成为近年来研究的热点。为了扩大产酸酵母菌种的筛选范围，我们对实验室现保存120株海洋解脂耶罗威亚酵母菌进行了筛选，获得了1株高产柠檬酸的菌株Y.lipolyticaSWJ-1b(中国海洋微生物菌种保藏中心编号2E00068)。该菌利用甘油(40.0 g/l)发酵产酸量为24.0±0.7g/l(柠檬酸生产力0.20g/lh)，高于陆地同种酵母菌相同条件下的发酵产酸量。通过进一步研究发现该菌发酵产酸的最佳碳源为葡萄糖，其用于产酸培养的最适浓度为40.0 g/l，发酵产酸量为25.5±1.2 g/l(0.21 g/lh)。
木薯淀粉(Cassava strach)应用于柠檬酸生产的前提是产酸菌株必须具备水解木薯淀粉的能力，但Y.lipolytica SWJ-1b不能分泌淀粉酶，且外源淀粉酶(Amylase)基因在Y.lipolytica SWJ-1b中难以表达。本实验室研究发现扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)IFO0111可以产生大量的淀粉酶，可使用该菌产生的淀粉酶先将木薯淀粉水解，所得木薯淀粉水解液(碳源浓度40.0 g/l)进而被用于发酵产酸，其柠檬酸产量为29.4±0.3 g/l(0.25 g/lh)。而在2-1发酵罐中分批补料发酵培养时，柠檬酸产量达60.2±1.8 g/l(0.21 g/l h)。
最近几年我们实验室研究发现菊粉(Inulin)也是发酵工业很好的原料，Y。lipolytica SWJ-1b同样不能产生菊粉酶，为了使产酸菌株能够直接利用菊粉发酵产酸以简化发酵生产工艺，我们将菊粉酶活力较高的马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS6556的菊粉酶(Inulinase)基因成功整合至Y。lipolytica SWJ-1b的基因组DNA，并通过表面展示技术将该基因表达的菊粉酶展示于Y.lipolytica SWJ-1b细胞表面，得到具稳定菊粉酶活力的转化菌株INU-87，其表面展示菊粉酶活力为22.6±0.8U/mg细胞干重，具有较高的外切酶活性。研究发现该表面展示菊粉酶与菌株K.marxianus的原始菊粉酶性质基本一致，且表面展示技术的应用使该酶易于回收利用。转化菌株INU-87在菊粉培养基(菊粉浓度40.0g/l)中一步发酵产酸时，柠檬酸产量为31.2±1.6g/l(0.26g/lh)，其在2-1发酵罐中发酵菊粉(100.0g/l)产酸量可达68.9±2.4 g/l(0.22g/lh)。转化菌株INU-87以非粮原料菊粉一步发酵产柠檬酸，节约了粮食资源，降低了柠檬酸的生产成本，简化了非粮原料发酵产酸工艺，对柠檬酸的工业生产具有深远意义。
产酸酵母菌最大的缺点在于发酵产酸过程中副产物异柠檬酸(Iso-citrateacid，ICA)产量和菌体油脂(Lipid)累积量较高，对柠檬酸产量的提高极为不利。产酸代谢途径中的异柠檬酸裂解酶(Iso-citrate lyase ICL)能够减少异柠檬酸的产量，而ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase ACL)则促进油脂累积。为了减少发酵产柠檬酸过程中的副产物产量，本实验通过转化菌株INU-87 ACL1基因敲除和ICL1基因超表达，得到遗传改良菌株IAI-30。该菌株的ACL1基因表达量降低了18.9％，受该基因控制的ACL酶活力明显降低；同时，其ICL1，基因表达量增加了259.4％，ICL酶活力有较大提高。经测定遗传改良菌株IAI-30的油脂累积量和副产物异柠檬酸的产量都明显降低，其在菊粉产酸培养基(菊粉浓度40.0g/l)中发酵产酸量增至36.0±0.6g/l(0.30g/lh)。而遗传改良菌株IAI-30在2-1发酵罐中一步发酵菊粉(100.0g/l)产酸量可达84.0±1.6g/l(0.39g/l h)。遗传改良从基因水平上对产酸菌株的产酸代谢途径做出了一定调整，降低了发酵产酸过程中的副产物产量，有效提高了柠檬酸产量及碳源转化率。
利用钙盐法从发酵液提取得到柠檬酸结晶，反复纯化后使用高效液相色谱分析，发现提取的柠檬酸样品纯度高达95.0％(w/w)。
柠檬酸;解脂耶罗威亚酵母;菊粉酶;酵母表面展示;基因敲除;遗传改良
中国海洋大学
博士
微生物学
池振明
2012
中文
TQ921.1
150
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）