人工纳米氧化锌颗粒对牙鲆FG细胞和斑马鱼胚胎的毒性及其毒性作用机制
纳米氧化锌(nZnO)因具有独特的光催化作用、紫外吸收能力和杀菌作用，已被广泛地运用到人类日常用品中，如纺织品、化妆品、牙膏和抗菌剂等，由其所引起的生物毒性效应也引起了人们的广泛关注。本文拟利用海水鱼类牙鲆的鳃细胞系(FG)来比较研究3种粒径的ZnO颗粒(30 nm、80-150 nm和2μm)的细胞毒性效应，利用斑马鱼胚胎来比较研究这3种粒径ZnO颗粒的胚胎毒性，以了解ZnO颗粒的毒性效应与其粒径大小的关系。在细胞毒性检测中，采用MTT法、乳酸脱氢酶(LDH)检测法和Hoechst33342/PI双荧光染色法及DNA片段化法，来分别检测这3种粒径的ZnO颗粒对FG细胞的生长抑制、细胞膜损伤和凋亡诱导能力。在胚胎毒性检测中，观察这3种粒径的ZnO颗粒对斑马鱼胚胎孵化率和致畸性的影响。为了探讨ZnO颗粒的毒性与其锌离子(Zn2+)释放量的相关性，本文还研究了ZnCl2对FG细胞的毒性，以及不同处理浓度下3种粒径ZnO颗粒在PBS中的锌离子(Zn2+)释放量。为了探讨这3种粒径ZnO颗粒的团聚效应与其毒性的关系，本文还比较研究了超声波处理和血清对ZnO颗粒团聚程度及其毒性效应的影响。本文的研究结果为进一步加深人们对纳米ZnO颗粒的毒性及其致毒机制的了解，为人工纳米材料的环境污染生物检测系统的建立奠定基础。
MTT分析的结果表明，3种ZnO颗粒都可以抑制FG细胞的生长，而且这种抑制作用具有明显的浓度依赖性和时间依赖性。30 nm、80-150 nm和2μm ZnO颗粒对FG细胞的24 h的IC50(半数抑制浓度)值分别为：5.136(3.9-6.8)、5.826(4.1-8.3)和6.473(4.3-9.7)μg/ml(95％的置信区间)，毒性大小为30 nm>80-150 nm>2μm。可见，3种粒径ZnO颗粒对FG细胞生长的抑制作用表现出了明显的粒径效应，随着ZnO颗粒粒径的减小而毒性增大；而且ZnO颗粒的浓度越低，这种粒径效应越明显。LDH分析的结果表明，随着ZnO颗粒浓度的升高，3种粒径ZnO颗粒处理组的FG细胞培养上清中的LDH活性也随之增加，具有一定的剂量效应关系，LDH相对活性最低在25％左右，最高在50％左右。这表明FG细胞的细胞膜的完整性发生了改变，使存在于细胞质内的LDH泄露到培养基中。Hochest33342/PI双荧光染色的结果也表明，3种粒径的ZnO颗粒都可以引起FG细胞的凋亡和坏死。随着浓度的增高，每种粒径的ZnO颗粒所引起的FG细胞的凋亡和死亡的细胞总数都逐渐增加，具有明显的剂量效应关系。而且，即使每种粒径的ZnO颗粒在高浓度(100和50μg/ml)时出现较多的死细胞，但其毒性都是以诱导细胞凋亡为主。在所检测的暴露浓度条件下，3种粒径的ZnO颗粒虽然诱导了FG细胞的凋亡，但还没有引起基因组DNA的片段化。
三种粒径ZnO颗粒在PBS中的锌离子释放量的检测结果表明30nm、80-150nm和2μm的ZnO颗粒在PBS中都会溶解出Zn2+，且随着ZnO颗粒浓度的增高，释放量也逐渐增加。MTT法检测不同浓度氯化锌(ZnCl2)对FG细胞的细胞毒性结果表明，ZnCl2对FG细胞具有明显的生长抑制作用，而且随着ZnCl2浓度的升高，抑制作用逐渐增强，细胞的活性逐渐降低。30 nm、80-150nm和2μm的ZnO颗粒及ZnCl2的IC50值分别为0.08、0.072、0.063、0.075μmol/ml，而30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO颗粒在最高浓度100μg/ml时Zn2+的释放量分别为：1.12±0.054，1.86±0.08和1.54±0.065μg/ml，即0.023±0.001，0.029±0.0012和0.017±0.0008μmol/ml均没有超过0.03μmol/ml，与其IC50值相比，此浓度不足以引起实验中所测得的毒性，因此，我们认为ZnO颗粒所释放的Zn2+产生的毒性只是导致ZnO颗粒产生毒性的部分原因。本文比较了经超声波处理和未处理的30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO颗粒对FG细胞的毒性，发现经超声波处理的3种ZnO颗粒对FG细胞的毒性效应要明显高于未经超声波处理的3种粒径ZnO颗粒的毒性，且这种差异在高浓度(100和50μg/ml)时更为显著，这表明，超声波处理后有利于ZnO颗粒的分散，使其易于穿透细胞膜，而不经超声波处理的ZnO颗粒会团聚成较大的团块，从而降低其穿透细胞膜的能力和数量，因而毒性降低。本文还发现血清有助于降低ZnO颗粒的团聚程度，从而影响ZnO颗粒的细胞毒性结果。总之，ZnO颗粒的团聚程度也是影响其毒性效应的重要因素。
3种粒径ZnO颗粒对斑马鱼的胚胎毒性结果表明，3种粒径的ZnO颗粒均会影响斑马鱼胚胎的发育，造成处理组斑马鱼胚胎9 h时发育停滞，而且发育停滞的胚胎在24 h后大部分死亡；在受精72 h后，3种粒径ZnO颗粒处理组胚胎的孵化率相比对照组出现了明显的降低；3种粒径ZnO颗粒对斑马鱼胚胎的致畸率和死亡率没有明显的浓度依赖性，且9 h时的致畸率和24 h时的死亡率相似；3种粒径ZnO颗粒对斑马鱼胚胎的孵化率的影响具有明显的浓度依赖性，在高浓度(100和50μg/ml)时，斑马鱼胚胎的孵化率都为零，但是在10μg/ml时，30 nm、80-150 nm和2μm的ZnO颗粒处理的斑马鱼胚胎的孵化率分别为0，11.54％±2.2％，36.7％±7.3％，说明随着ZnO颗粒粒径的减小，对斑马鱼胚胎孵化率的影响增大。
总之，本文通过比较研究3种粒径ZnO颗粒对体外培养FG细胞的细胞毒性及其对斑马鱼胚胎的胚胎毒性，发现这3种粒径的ZnO颗粒对FG细胞的细胞毒性与其粒径大小、所释放的Zn2+浓度和团聚程度有关。粒径越小，毒性越大。3种粒径ZnO颗粒对斑马鱼胚胎的毒性主要表现为导致发育停滞、死亡和降低孵化率。
纳米氧化锌;牙鲆鳃细胞系;细胞毒性;细胞凋亡;斑马鱼;胚胎毒性
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
郭华荣;王晓飞
2012
中文
X174;TB383
80
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）