双氯芬酸钠对三种人角膜细胞的凋亡诱导作用研究
双氯芬酸钠(Diclofenac Sodium，DFS)是一类重要的眼用非甾体抗炎药，通过抑制环氧化酶和脂氧化酶活性减少前列腺素、白三烯等炎性因子的合成和释放，从而发挥抗炎、镇痛的作用，同时具有保护血眼屏障的功能。近年来，DFS被广泛应用于眼科。现已有文献报道DFS能抑制成纤维细胞和兔角膜上皮细胞增殖，提示高浓度和长时间用药可能会损伤正常细胞。目前关于眼科药物对角膜细胞影响作用的研究主要通过动物实验和临床实验进行，耗资大且耗时多，在很大程度上限制了对眼科药物的研究范围和进程。而体外培养的人角膜细胞系作为体外模型进行药物毒性研究具有均一性好、反应速度快、经济方便等诸多优点，使得人角膜细胞系在眼科药物毒理学研究中的应用越来越广泛。本文利用实验室自建的非转染人角膜上皮细胞(HCEPC)、人角膜基质细胞(HCSC)和人角膜内皮细胞(HCEC)的细胞系作为体外研究体系，研究了DFS对HCEPC、HCSC和HCEC的毒性作用，为了进一步证明其对在体角膜的影响作用，本文以家猫为实验动物进行了体内毒性作用研究，最终根据体外实验和体内实验的研究结果准确评价了DFS对角膜细胞的毒副作用，进一步为DFS的临床应用提供实验依据。
为了检测不同浓度DFS对三种人角膜细胞的影响作用，确定可引起细胞凋亡的有效药物浓度及其处理时间，本实验在现有临床使用浓度(1g/L)的基础上，倍比降低药剂浓度至0.03125 g/L，通过光镜观察发现1g/L、0.5 g/L、0.25 g/LDFS在28 h内均可引起HCEPC、HCSC和HCEC形态发生变化，细胞皱缩变圆直至脱壁死亡，证明DFS在浓度高于0.25g/L时对三种人角膜细胞均具有显著的细胞毒性。
为了确定不同浓度DFS处理不同时间对三种人角膜细胞的毒性作用，本实验进行了吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光双染色实验，结果发现HCEPC、HCSC和HCEC的凋亡率与DFS的作用浓度和作用时间呈明显的正相关性。HCEPC经1 g/L和0.5 g/L DFS分别处理16 h和24 h后，细胞凋亡率到达100％；0.25 g/L、0.125 g/L，和0.0625 g/L DFS处理HCEPC28 h后的细胞凋亡率分别是27.77％、25.00％和19.76％。1 g/L和0.5 g/LDFS分别处理HCSC8 h和16 h后，细胞凋亡率到达100％；0.25g/L、0.125g/L和0.0625g/L DFS处理HCSC28 h后的细胞凋亡率分别是75.21％、58.76％和26.43％。1g/L、0.5 g/L，和0.25g/L DFS分别处理HCEC8 h、20 h和28 h后，细胞凋亡率到达100％；0.125g/L和0.0625g/LDFS处理HCEC24 h后的细胞凋亡率分别是21.59％和19.64％。实验结果证明DFS在浓度高于0.06525 g/L时均能诱导三种人角膜细胞的质膜通透性增大，可能DFS的毒性作用是通过诱导人角膜细胞凋亡来实现的。
为了进一步确定DFS对三种人角膜细胞的凋亡诱导作用，本文又利用DNA琼脂糖凝胶电泳和透射电镜进行了鉴定。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示，经0.5g/L和0.25 g/L DFS分别处理16 h和28 h后的HCEPC，经0.5g/L和0.25g/L DFS分别处理8 h和24 h后的HCSC，以及经1g/L、0.5g/L和0.25g/L DFS分别处理4 h、12 h和20 h后的HCEC，其DNA在琼脂糖凝胶电泳中均出现了典型的梯状条带，即DNA出现了断片化。然后分别选取0.5g/L DFS处理12 h后的HCEPC、0.25g/L DFS处理20 h后的HCSC和0.5g/L DFS处理12 h后的HCEC，经固定、切片后进行了透射电镜观察，结果显示HCEPC、HCSC、HCEC均出现了染色质浓缩且于核内呈边缘化分布、胞质空泡化和凋亡小体，证明浓度高于0.25g/L的DFS确能诱导三种人角膜细胞发生细胞凋亡。
为了验证DFS对在体角膜细胞的凋亡诱导作用，本文利用DFS处理家猫的角膜细胞进行在体检测与鉴定。按照临床用药剂量滴用DFS滴眼液，持续用药2 wk，并利用角膜内皮镜测定了家猫角膜内皮细胞的密度、角膜内皮细胞平均面积、六角形细胞比率、细胞面积变异率(CV值)等数据，跟踪检测结果表明，自滴药日起20 d内，家猫角膜内皮细胞密度明显下降，角膜内皮细胞平均面积增大，均与对照眼差异显著(P<0.01)，CV值上升，六角形细胞比率下降，但与对照眼并无明显差异(P>0.05)。观测40 d后对家猫角膜取材，通过茜素红染色、冰冻切片及HE染色、扫描电镜和透射电镜观察等实验方法进行了鉴定，茜素红染色结果显示，家猫实验眼角膜内皮细胞密度和六角形细胞比率明显下降，部分区域细胞面积变大。HE染色结果显示家猫实验眼角膜基质胶原纤维结构变疏松，可能与DFS诱导MMPs的过度表达有关。扫描电镜结果显示家猫实验眼角膜有少量内皮细胞发生凋亡，透射电镜结果显示其角膜上皮细胞细胞间连接被破坏。以上实验结果验证了DFS对家猫角膜细胞的凋亡诱导作用。
本文以非转染HCEP细胞系、HCS细胞系和HCE细胞系作为体外研究体系，证实了DFS对HCEPC、HCSC、HCEC的凋亡诱导作用，并通过家猫在体实验验证了其对猫角膜细胞的凋亡诱导作用。研究结果证实DFS对角膜细胞具有极大的毒性作用，能引起角膜细胞凋亡，因此，临床应用时应避免使用DFS，或使用其他无毒副作用的非甾体抗炎药，并积极开发绿色的的无毒副作用的新型抗炎药，尽可能避免或减少眼用药物对人角膜的毒性损伤。
双氯芬酸钠;角膜细胞;凋亡诱导作用;眼用非甾体抗炎药;动物模型
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
樊廷俊
2012
中文
R96
64
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）