南极大磷虾胰蛋白酶分离纯化及其促进创伤修复作用研究
南极大磷虾(Euphausia superba)隶属于节肢动物门甲壳纲，是生活在南极海域的一种嗜冷生物，以其巨大的生物量和潜在的应用价值日益受到人们的关注。南极大磷虾体内含有多种蛋白酶，蛋白降解系统较为独特而且降解效率较高，而这些蛋白酶活性40％来源于胰蛋白酶。其胰蛋白酶是一种适冷酶，在低温下具有较高的催化活性，并且具有较低的最适催化温度，由于南极大磷虾体内蛋白酶系统同时具有外切酶和内切酶活性，用于清除坏死机体组织、纤维以及血痂非常有效，能显著加快伤口愈合，因此，南极大磷虾酶制剂具有广泛的医学用途。
本实验从南极大磷虾体内提取胰蛋白酶。通过采用20-70％硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacry1 S100凝胶过滤层析，然后将样品进行SDS-PAGE，发现纯化得到一种分子量为32.0KDa的胰蛋白酶组分，作为动物实验中所用的纯化酶。
采用全层皮肤缺损法建立新西兰大白兔创伤模型，在兔背后造4个约2cm×2cm方形创面，将创面分为粗酶组、纯化酶组、木瓜蛋白酶组和生理盐水组四组，每天给药两次，每次0.5mL，直至伤口愈合。连续观察创面形态学变化，评价创伤表面瘢痕、测量伤口表面积、观察创伤组织切片、测定皮肤羟脯氨酸含量比较各组创伤愈合效果。结果显示，相比于木瓜蛋白酶，从南极大磷虾中提取的粗酶和纯化的胰蛋白酶具有良好的促进愈合效果，尤其是粗酶，能明显促进动物创面的愈合，并明显缩短创面愈合时间，还能显著提高在创伤15天羟脯氨酸含量。初步表明南极磷虾胰蛋白酶有增加胶原沉积，增加蛋白质合成，加速上皮组织再生，促进肉芽组织形成等作用。
EGF及bFGF是影响创伤修复的两种比较关键的生长因子。测定表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)含量。建模后第十天、十五天，粗酶组和纯化酶组EGFR、bFGF的表达水平较高，相较于木瓜蛋白酶组和生理盐水组差异显著，且粗酶组EGFR、bFGF的表达速度最快(10天左右达到最高峰)，因而认为粗酶可能通过调节EGFR、bFGF的表达来发挥其促创伤修复作用。胰蛋白酶促进创伤修复的作用机制可能有两个方面：第一是粗酶溶液含有多种其它活性物质，如多糖、蛋白等，而甲壳素已经被证实有促进伤口愈合的作用，可能是粗酶中的胰蛋白酶和甲壳素等多糖起协同作用，共同促进了创面的修复，因此粗酶修复效果最佳；第二是胰蛋白酶可能在创伤修复过程中能诱导刺激生长因子的释放，从而加速修复过程，提高修复质量。
南极大磷虾;胰蛋白酶;创伤修复;分离纯化;表皮生长因子;碱性成纤维细胞生长因子
中国海洋大学
硕士
微生物学
姜国良
2012
中文
R641;Q814.1
73
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）