养殖大菱鲆4种致病菌多重PCR和荧光定量PCR检测方法的建立
大菱鲆(Scophthalmus maximus)于1992年引入我国，并在1999年繁育成功后，成为我国第四次海水养殖浪潮的主要品种，是我国北方沿海地区工厂化养殖的主导鱼类。然而，随着养殖规模的迅速扩大和集约化程度的不断提高，各类病害接踵而至，病害问题已成为制约大菱鲆产业可持续发展的重要瓶颈。近十年来的流行病学调查结果表明，大菱鲆疾病以细菌性疾病为主，其中哈维氏弧菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌是常见致病菌，具有较强的致病性。为有效遏制疾病的发生、减少经济损失，迫切需要建立大菱鲆重要致病菌的快速、准确、实用的检测方法。因此，本研究以这4种致病菌为研究对象，建立多重PCR检测技术和荧光定量PCR检测技术，以期为疾病的快速诊断及防治提供技术支撑。
1、哈维氏弧菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌的多重PCR检测技术的建立：在GenBank数据库中下载哈维氏弧菌的vhhP2基因序列，设计其特异性引物；下载鳗弧菌的金属蛋白酶基因序列，设计其特异性引物；通过克隆gyrB基因的部分序列和序列比对分析，分别设计了灿烂弧菌和鳗弧菌的gyrB基因特异性引物。实验证明四对引物的特异性和通用性良好，对非目的菌种无交叉反应，对目的菌种的不同来源的菌株有扩增。哈维氏弧菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、迟缓爱德华氏菌的特异性产物大小依次为151bp、412bp、251bp、582bp，经琼脂糖电泳后，能明显区分，无非特异性扩增来干扰实验，所以本实验能在一次PCR反应中同时检测出这4种致病菌。多重PCR最低能检测到哈维氏弧菌3.9×104 CFU/反应，基因组DNA354.9 pg，鳗弧菌6.8×104 CFU/反应，基因组DNA201.5 pg，灿烂弧菌5.8x104 CFU/反应，基因组DNA204.7 pg，迟缓爱德华氏菌3.2×105CFU/反应，基因组DNA967 pg。
2、哈维氏弧菌荧光定量PCR检测技术：根据vhhP2基因设计哈维氏弧菌的荧光定量PCR引物，扩增的目片段与pMD18-T载体连接，构建的重组质粒用来作为标准品。选取部分稀释度的标准品来检验标准曲线的重复性。实验结果显示，3个重复的Ct值基本一致，组内重复性良好；不同时间构建的标准曲线，经方差分析知，多数标准品的P值大于0.05，说明组间重复性良好，标准品稳定，可以提供稳定检测结果。根据标准品拷贝数的对数值(10X)与Ct值(y)的关系构建了标准曲线，y=-3.331x+37.48，相关系数R2=0.998，扩增效率为1.00，最低能检测到7个拷贝。
3、灿烂弧菌荧光定量PCR检测技术：测序获得灿烂弧菌的gyrB基因序列，以此为靶基因设计特异性引物，构建质粒作为标准品。扩增后所得的标准曲线为y=-3.338x+37.67，相关系数R2=0.999，扩增效率为0.99，组内重复性和组间重复性良好。灿烂弧菌荧光定量PCR技术最低能检测到20个拷贝。
4、迟缓爱德华氏菌的荧光定量PCR检测技术：测序获得迟缓爱德华氏菌的gyrB基因序列，以此为靶基因设计特异性引物，构建标准品。获得较为理想的标准曲线，y=-3.32x+39.38，相关系数R=0.998，扩增效率为1.00，而且组内重复性和组间重复性良好。迟缓爱德华氏菌的荧光定量PCR技术最低能检测到60个拷贝。
5、致病菌快速检测技术的应用：采集大菱鲆病样，利用建立的多重PCR技术和荧光定量PCR技术对其致病菌进行检测，两种快速检测方法对致病菌的鉴定结果为迟缓爱德华氏菌。同时利用传统分子鉴定方法-16S rDNA进行鉴定，进一步验证了此检测结果的正确性。
本研究建立了上述4种大菱鲆重要致病菌的多重PCR和实时定量PCR检测技术。多重PCR可在一次PCR反应中完成4种病菌的定性检测，而荧光定量PCR可对相应致病菌进行定量检测，定性与定量相结合，又相互验证，对大菱鲆这4种常见致病菌检测能达到准确快速定量的目的，这将为大菱鲆疾病的防控和健康养殖提供了强有力的技术支撑。
大菱鲆;致病菌;荧光定量PCR;快速诊断;健康养殖;可持续发展
中国海洋大学
硕士
微生物学
陈吉祥;王印庚
2012
中文
X943
81
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）