龙须菜泛素激活酶和泛素结合酶基因克隆及热激下表达模式分析
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种产琼胶的重要经济红藻，原产地为山东省和辽宁省。以青岛野生型龙须菜为出发藻种选育得到耐热新品系981和07-2，实现了龙须菜的南移栽培，带来了巨大的经济效益和社会、生态效益。但这两个品系在南方自然海域仍不能成功渡夏，因此迫切需要培育性状稳定、耐热性更强的新材料，为此龙须菜对高温胁迫的响应机制成为亟待研究的首要问题。诸多研究表明，泛素蛋白酶降解途径作为机体内特异高效降解蛋白质的途径，在机体耐热方面起到积极作用。泛素激活酶和泛素结合酶分别是泛素蛋白酶途径中第一步和第二步发挥作用的酶，对于它们的研究可以为探讨泛素蛋白酶降解途径在龙须菜高温胁迫响应中的作用打下基础。
本实验室通过构建龙须菜高温胁迫差异表达的抑制消减杂交文库，筛选得到了龙须菜泛素激活酶和泛素结合酶的表达序列标签，表明泛素蛋白酶降解途径在龙须菜的高温胁迫响应中发挥作用。本研究以野生型、981和07-2龙须菜为实验材料，首次克隆得到龙须菜中泛素激活酶和泛素结合酶基因全长序列，结果表明龙须菜泛素激活酶基因全长1206bp，仅由一个外显子组成，开放阅读框全长981bp，编码326个氨基酸，分子量约为35.4kD，推导的氨基酸序列中含有保守的ATP结合位点(LYDRQIRL WGLE、ELAKNVLLAGV、LKEMN、VVACI)和泛素分子激活域标志位点(VVCAI...LMTEAC、VFLDLGDEYSYQ、AIVGGMWGRE)；野生型、981和07-2龙须菜中泛素激活酶基因无差别。得到的龙须菜泛素结合酶基因全长882bp，由4个外显子和3个内含子组成，开放阅读框长444bp，编码147个氨基酸，分子量约为16.5kD，推导的氨基酸序列中含有保守的泛素活化位点(GSICLDIL)、泛素结合位点(RIYHPNIN、KVLISICSLL、DDPLV)以及泛素连接酶(E3)识别位点(KRI、YPF、WSP)；07-2龙须菜中泛素结合酶基因相对于野生型和981龙须菜有3个碱基位点突变，突变位点发生在内含子部分。
热激后(28℃、32℃和36℃)，进行Realtime-PCR分析表明：野生型龙须菜在28℃下，泛素激活酶和泛素结合酶基因均上调表达以清除机体内受损的蛋白，而在32℃和36℃下，二者表达量均低于正常水平，可能与高温使得机体内转录、翻译等酶失活有关，这一结果说明对于野生型龙须菜，高于28℃的高温胁迫会严重损伤机体的蛋白合成和折叠，并且无法通过泛素蛋白酶降解途径进行修复，从而使机体正常的生命代谢受到严重影响。981龙须菜在28℃下，泛素激活酶和泛素结合酶基因在6h和72h表达量高于正常值，在32℃下，二者的上调表达的时间延长并且表达量也高于28℃的表达量，这与981龙须菜的高温耐受能力高于野生型龙须菜相一致，而在36℃下，可能由于高温使得机体内转录、翻译等酶的失活，只有泛素结合酶在热激初期表达量升高，之后表达量低于正常值，泛素激活酶则始终下调表达。07-2龙须菜的泛素激活酶和泛素结合酶基因在36℃的高温胁迫下表达量仍可升高，表明07-2龙须菜在36℃的高温胁迫下仍可调动两种酶的表达以清除受损蛋白，这与07-2龙须菜相比于野生型和981龙须菜具有高温耐受能力相一致。
本论文研究了泛素蛋白酶降解途径中的两个关键酶-泛素激活酶和泛素结合酶在龙须菜处于高温胁迫下表达量的变化情况，结果表明他们在高温胁迫下能够积极上调以应对高温胁迫带来的伤害，并且分析发现泛素激活酶和泛素结合酶在高温胁迫下的表达量与龙须菜的高温耐受性直接相关。本研究将为揭示龙须菜高温胁迫响应分子机制奠定理论基础，并为龙须菜耐高温新材料的选育提供可用的基因信息。
龙须菜;泛素激活酶;泛素结合酶;高温胁迫;基因克隆
中国海洋大学
硕士
生物工程
臧晓南
2012
中文
Q949.29;Q785
86
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）