文昌鱼VEGF与VEGFR的时空表达与功能初探
血管内皮生长因子VEGF及其受体VEGFR是血管生成的重要促进因子，能刺激血管内皮细胞增殖、迁移、促进血管形成、增强血管通透性。通过基因组数据库搜索，发现单拷贝的VEGF和VEGFR。本文克隆了文昌鱼VEGF和VEGFR，对其序列进行分析，并进一步研究其表达与功能。
文昌鱼VEGF的最大开放阅读框(ORF)长1047bp，编码由348个氨基酸组成的蛋白，含有PDGF结构域，推测蛋白分子量为39kDa。序列比对分析表明，文昌鱼VEGF与脊椎动物的序列同源性较低，约为30％-34％，在PDGF结构域处稍高为46%-48%。其中与VEGF-C和VEGF-D的相似性比与VEGF-A和VEGF-B高。内含子外显子时相分析显示，文昌鱼VEGF也与VEGF-C和VEGF-D相近，其第5号外显子对应VEGF-C和VEGF-D的第5、6号外显子，各外显子大小相近，且内含子类型相同。共线性分析表明，除了VEGF-A，脊椎动物VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D基因座位和文昌鱼VEGF的相似。更进一步的系统进化分析表明，文昌鱼VEGF与VEGF-C和VEGF-D聚为一类，并位于其分支的基部。上述分析表明文昌鱼VEGF很可能具有脊椎动物VEGF-C和VEGF-D分子的特性。
文昌鱼VEGFR已克隆一段4075bp长的片段，在基因组中仅存在单一拷贝，其中ORF长3873 bp(还缺少3’末端39个碱基)，编码蛋白含有1290个氨基酸，含有膜外的七个免疫球蛋白样结构域、跨膜区和膜内的酪氨酸激酶结构域，推测蛋白分子量为143kDa左右。文昌鱼VEGFR与脊椎动物VEGFR序列同源性约在33％-35％之间，其中在IG结构域的序列同源性仅为27％-29％，而在酪氨酸激酶结构域处为59％-61％，暗示胞外区受到较大的选择压力。内含子外显子类型分析表明，从文昌鱼VEGF到脊椎动物VEGFRs进化过程中外显子发生合并和分化，但内含子类型不变。共线性分析显示，在VEGFR1-4上都存在有文昌鱼VEGFR的临位基因。系统进化分析表明，文昌鱼VEGFR出现于基因复制之前，位于脊椎动物VEGFRs分支的基部，暗示VEGFR的功能可能比较原始。
我们通过实时荧光定量PCR和原位杂交实验确定文昌鱼VEGF和VEGFR的表达图示。实时定量PCR显示，在胚胎发育过程中，VEGF和VEGFR在胚胎发育早期2-8细胞时就有表达，且随发育时间表达量上升，囊胚期表达量最高，进入神经胚之后逐渐降低。在成体中总的表达量很低，但仍集中表达于鳃、肝盲囊、消化道中。整体原位杂交结果显示VEGF和VEGFR在原肠胚之前的信号较强，囊胚和原肠胚期二者信号在整个胚胎皆有表达；神经胚期信号减弱，存在于内胚层和中胚层；幼鱼中的信号微弱，出现在消化道和鳃；切片原位杂交显示，二者信号在成体中集中于鳃、肝盲囊和卵巢中，肠中亦有表达。结合实时定量和原位杂交的结果，发现VEGF和VEGFR在胚胎以及成体中的表达模式基本一致，暗示二者存在潜在的相互作用，此点仍需蛋白水平的定位和互作实验来确定。
用细菌感染成鱼，通过实时荧光定量PCR实验观察，发现VEGFR的表达上调，VEGF不变。推测VEGFR与免疫相关，这一点仍需要体外细菌结合或抑菌实验来验证。
文昌鱼;内皮生长因子;序列分析;VEGF受体;克隆表达
中国海洋大学
硕士
生物工程
汲广东
2012
中文
S917.4;Q786
86
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）