羧甲基壳聚糖纳米微粒的制备及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响
瘢痕疙瘩是皮肤损伤后引发的胶原异常积聚所致的过度瘢痕化，其产生原因主要是由于瘢痕疙瘩成纤维细胞合成与分泌胶原能力的增强或此种细胞的大量增殖。羧甲基壳聚糖(羧甲基壳聚糖)作为一种水溶性的壳聚糖(CS)衍生物，具有良好的生物相容性和组织亲和性，它能够促进皮肤成纤维细胞生长，在皮肤软组织修复方面有着较好的应用。本文构建了羧甲基壳聚糖纳米微粒体系，利用黄种人瘢痕疙瘩组织体外培养得到瘢痕疙瘩成纤维细胞，研究了羧甲基壳聚糖纳米微粒体系对于瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响，并初步讨论了其作用机理。
1、羧甲基壳聚糖纳米微粒的制备和性质检测
通过碱化溶胀壳聚糖和氯乙酸的取代反应，制备了两种不同分子量(196kDa和6.3kDa)的羧甲基壳聚糖样品，分子量为196kDa的羧甲基壳聚糖经双氧水降解6h、9h后，得到了分子量为16kDa和7.5kDa的羧甲基壳聚糖，所制备的四种羧甲基壳聚糖样品具有良好的水溶性，并且脱乙酰度(DD)和羧甲基度(DS)基本相同(DD：92％±2％；DS：78％±3％)。通过离子交联法制备了四种分子量不同的羧甲基壳聚糖纳米微粒。通过红外光谱检测证明了羧甲基壳聚糖以及羧甲基壳聚糖纳米微粒被成功合成。随后通过透射电镜以及动态光散射粒度分析仪检测了羧甲基壳聚糖纳米微粒的表观形态和粒度分布。结果表明，羧甲基壳聚糖纳米微粒呈规则球形，无粘连，且粒径分布在180nm-250nm。
2、瘢痕疙瘩成纤维细胞的体外培养
利用黄种人瘢痕疙瘩组织体外培养得到瘢痕疙瘩成纤维细胞。原代培养10-15天后，在瘢痕疙瘩组织块附近，成纤维细胞从组织块周围迁移出来，并伴有少量的上皮细胞生长，经3-5次传代培养后，上皮细胞消失，瘢痕疙瘩成纤维细胞大量生长。通过对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线的绘制，发现瘢痕疙瘩成纤维细胞在传代后的第二天达到对数生长期。
3、羧甲基壳聚糖纳米微粒对于瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响
采用MTT法，研究了不同浓度、不同作用时间以及不同分子量的羧甲基壳聚糖纳米微粒对于瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。结果表明：不同分子量的羧甲基壳聚糖纳米微粒对于瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖均有抑制作用，羧甲基壳聚糖纳米微粒的作用浓度在2μ g/mL-200μ g/mL时，抑制率随着羧甲基壳聚糖纳米微粒作用浓度的增加而升高，当羧甲基壳聚糖纳米微粒浓度为100μ g/mL时，达到最小抑制浓度，对于四种分子量不同的羧甲基壳聚糖纳米微粒，瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制率随着羧甲基壳聚糖纳米微粒分子量的降低而升高，分子量为6.3kDa的羧甲基壳聚糖纳米微粒具有最高抑制率，达到48.79％。与羧甲基壳聚糖水溶液相比，羧甲基壳聚糖纳米微粒对于瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制率随着时间(1天-6天)的变化，表现出前低后高的趋势，当作用时间达到6天时，羧甲基壳聚糖纳米微粒与羧甲基壳聚糖水溶液对于瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制率基本相同(羧甲基壳聚糖纳米微粒：48.79％；羧甲基壳聚糖水溶液：49.69％；p=0.844)。通过比较壳聚糖、羧甲基壳聚糖水溶液和羧甲基壳聚糖纳米微粒对于瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制效果，发现羧甲基基团起主要抑制作用。
本论文中，我们成功构建了羧甲基壳聚糖纳米微粒体系，首次应用于瘢痕疙瘩的治疗研究中，初步讨论了其对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响以及作用机理，为羧甲基壳聚糖纳米微粒体系应用于皮肤软组织修复以及瘢痕预防与治疗提供了一定的理论基础。
羧甲基壳聚糖;纳米微粒;瘢痕疙瘩;成纤维细胞;增殖抑制;体外培养
中国海洋大学
硕士
生物工程
陈西广
2012
中文
R318.08;R963
68
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）