海洋溶胶细菌Flammeovirga sp.MY04琼胶酶(系)的研究
海洋细菌Flammeovirga sp.MY04能直接液化琼脂糖，生成水溶性低聚糖和寡糖，具备用于固相发酵的潜力。因此，MY04是1株高效的琼胶酶资源菌，具有良好的应用价值和开发意义。
本文先后通过MY04胞外琼胶酶系的分析、基因文库的构建与琼胶酶基因的筛选，及基因组的测序与琼胶酶系的分析，进行了Flammeovirga sp.MY04琼胶酶资源的初步发掘，分析了菌株具有溶胶能力的遗传学基础。本文还系统地研究了琼胶酶AgaG4的酶学性质、新颖结构的功能与相关机制。结果如下：
1.MY04胞外琼胶酶系的基本特征分析
在无琼脂糖底物的培养条件下，获得了MY04的胞外粗酶，证明胞外琼胶酶系由至少4条琼脂糖降解酶组成，分子量大小约30kDa-70kDa，整体上具有耐中等高温(0℃-50℃)、耐碱(pH6-10)和耐盐(0M-0.9M)的特性。经寡糖产物的纯化、阳离子质谱和13C-谱分析，将胞外酶降解琼脂糖后的主产物鉴定为新琼四糖、新琼六糖，间接证明MY04的胞外琼胶酶系是β-琼胶酶系。
2.MY04基因组DNA文库的构建与琼胶酶的基因筛选、分析
以pCC1Fos为载体，在E.coli EPI300中构建了MY04的基因组DNA文库，平均插入片段约30kb-36kb，覆盖约15Gbp的MY04基因组DNA。对文库进行的活性筛选没有获得任何琼胶酶基因。最后，通过文库中随机克隆插入片段末端的测序与分析、文库的PCR筛选与阳性质粒pAI2的鸟枪法测序，获得了1个编码GH16家族β-琼胶酶的基因agaG4。
琼胶酶AgaG4由503个氨基酸残基组成，序列中含有在GH16家族β-琼胶酶中保守的8个糖基结合位点、2个催化位点和3个Ca2+结合位点。AgaG4具有模块化的组成特征，包括N-端信号肽、1个GH16模块、1个富含Gly-/Ser-残基的链接区、1个推定的碳水化合物结合模块和1个与膜定位相关的模块。这些功能模块的组成方式有两个新颖之处：一是GH16模块中含有不常见的由连续57个氨基酸(N246-G302)组成的肽段；二是C-端非催化结构域由可归类于CBM2或CBM5家族的几丁质结合域(ChtBD3)、por分泌系统膜整合结构域组成，这是琼胶酶一个新颖的模块化组织方式。系统发育分析表明，AgaG4与F.yaeyamensisYT的β-琼胶酶AgaYT、Microscilla sp.PRE1推定的β-琼胶酶MS116，构成GH16家族β-琼胶酶的一个亚家族分支。
3.琼胶酶AgaG4的异源表达、酶学鉴定，及其特殊模块结构的功能、机制分析
(1)琼胶酶AaG4的异源表达、重组酶制备与性质鉴定
用质粒pBAD/gⅢA在E.coli TOP10菌株中表达了基因agaG4，菌体中重组蛋白rAgaG4的表达量大于200mg/mL，含量接近30％。通过包涵体的纯化、变性溶解，及重组蛋白的Ni-亲和层析、复性，获得纯度大于97％的重组蛋白rAgaG4。复性后的rAgaG4具有专一的琼胶酶活性，酶活144U/mg，最适温度为50℃、最适pH为7.5，在0℃-50℃、pH6-9的范围内分别具有热稳定性和酸碱耐受性。重组酶rAgaG4在降解琼脂糖时表现为内切型降解模式。本章还建立了不依赖于13C-谱分析的琼寡糖、新琼寡糖的MS/MS鉴定方法，将两个寡糖终产物分别鉴定为新琼四糖、新琼六糖。这表明，尽管AgaG4与Eyaeyamensis YT的琼胶酶AgaY工具有98％的序列一致性，但它们的琼脂糖降解产物不同，因而是功能不同的琼胶酶。
本文的深入研究还通过寡糖总产物的荧光标记、HPLC分析，测定寡糖终产物中新琼四糖、新琼六糖的摩尔浓度之比是1.5:1，且总含量大于99％；测得寡糖总产率为72％-78％。重组酶rAgaG4的最小降解单元是新琼八糖，最小寡糖产物是新琼四糖。而且，在rAgaG4降解新琼十糖时，新琼四糖产生自非还原性末端。
综上，琼胶酶AgaG4是热稳定的、内切型GH16家族β-琼胶酶，在新琼四糖与新琼六糖的专一性制备中具有良好应用前景。相对单一的琼脂糖、寡糖降解方式提示，AgaG4具有严谨型的底物降解机制。
(2)琼胶酶AgaG4特殊模块结构的功能分析
用PCR技术对agaG4基因进行了截短改造，获得截除了AgaG4中C-端非催化结构域的编码序列、仅编码GH16模块的基因截短体agaG4-GH16，以及截除AgaG4的GH16模块中特殊肽段编码序列的基因截短体agaG4-T57。按照与基因agaG4同样的研究方法，分别获得纯度大于95％的重组蛋白截短体rAgaG4-GH16、rAgaG4-T57。
重组蛋白截短体rAgaG4-GH16与全长重组酶rAgaG4的酶学性质相似，差别在于起始复性浓度远低于rAgaG4、酶活大小是rAgaG4的35倍，这表明C-端非催化结构域对琼胶酶AgaG4的水溶性、活性大小具有显著影响。重组蛋白截短体rAgaG4-T57与重组酶rAgaG4的显著差异包括：最适温度为40℃；降解琼脂糖后的终产物包括新琼四糖、新琼六糖和新琼八糖，三者摩尔浓度之比为2.68:2.82:1；且rAgaG4-T57不能降解新琼八糖，其最小降解单元为新琼十糖。这些结果表明，GH16模块中的特殊肽段与琼胶酶AgaG4对新琼八糖的识别、降解作用密切相关。
(3)GH16模块中特殊肽段的关键位点及其功能、机制的分析
通过在线同源建模，获得了AgaG4的立体结构数据，分析后发现特殊肽段中的Y276位点位于催化腔的端口，侧链基团为含苯环的羟基，具有糖基结合潜力，判定为与新琼八糖降解相关的候选关键位点。
通过大引物错配PCR，扩增能表达微量水溶性AgaG4重组酶的pCTFG4质粒，获得一系列突变体。将空质粒pCold TF、重组质粒pCTFG4及其突变体，在E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达，分别获得含有水溶性重组蛋白的粗酶。结合关键位点突变后氨基酸残基的结构特征，比较了粗酶液降解琼脂糖后的产物，发现：Y276位点突变为Gly-位点后使全酶失活；Y276突变为侧链基团含苯环的Phe-位点时，含重组酶突变体的粗酶降解琼脂糖后，终产物无变化，仅含有新琼四糖与新琼六糖，与rAgaG4的产物一致；Y276突变为侧链基团不含苯环结构的Asp-、Glu-、Asn-、Ser-或Thr-位点时，含重组酶突变体的粗酶降解琼脂糖后，终产物除含有新琼四糖与新琼六糖外，还含有新琼八糖，与rAgaG4-T57降解琼脂糖后的终产物一致。
上述结果证明，在琼胶酶AgaG4中，除前文预测的8个糖基结合位点之外，GH16模块中特殊肽段的Y276位点是1个新的糖基结合位点，与酶对琼脂糖、新琼八糖的降解作用密切相关。推测该位点侧链基团中的苯环在酶对新琼八糖的结合中具有重要作用。
4.MY04全基因组序列的测定与琼胶酶系的分析
本文首次获得火色杆菌属细菌的全基因组序列。MY04的染色体基因组大小约7.2M，共编码与已知琼胶酶序列一致性大于等于30％的15条β-琼胶酶序列，涵盖GH16、GH50和GH86等3个琼胶酶家族的成员，数量分别为4条、1条和10条。其中12条琼胶酶基因在染色体3.5M-5.1M处聚集。相似性分析表明，GH16家族成员与Zobellia galactanivorans Dsij、Microbulbifer thermotolerans的琼胶酶序列一致性最高，介于30％-42％，其它家族成员与Saccharophagusdegradans2-40的琼胶酶序列最高，介于30％-45％。对MY04中所有琼胶酶序列进行的系统发育分析表明，GH86家族成员分别聚集成与Saccharophagusdegradans2-40的琼胶酶GH86C、GH86E相关的2个类群。
这表明，Flammeovirga sp.MY04含有丰富的琼胶酶资源，琼胶酶系组成完整，具有一定的多样性组成特征。但是，在MY04基因组可注释的序列中，未发现胞外琼胶酶系中大小为30kDa-40kDa琼胶酶的编码基因，表明该菌株琼胶酶资源的全面发掘、研究仍然需要将基因组学与酶学、蛋白质组学等技术相结合。
综上，Flammeovirga sp.MY04基因组所编码的琼胶酶资源丰富，琼胶酶系组成完整，是菌株具有溶胶能力的重要遗传学基础。MY04的胞外琼胶酶系组成复杂，具有耐中等高温、耐碱性环境，和耐盐的稳定性特征，在新琼寡糖的制备中具有一定应用价值。琼胶酶AgaG4含有特殊模块结构、且进化地位特殊，具有热稳定性，在新琼四糖、新琼六糖的专一性生产中具有良好应用前景；GH16模块中的特殊肽段与新琼八糖的识别、降解相关；Y276是特殊肽段中关键的糖基结合位点，侧链基团中的苯环在酶对底物的识别、降解作用中具有重要作用。上述研究为深入、全面地开发Flammeovirga sp.MY04的琼胶酶资源奠定了坚实基础。
火色杆菌;琼胶酶系;功能位点;海洋细菌
中国海洋大学
博士
药物化学
顾谦群;李越中
2012
中文
TQ925
130
2012-12-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）