仿刺参(Apostichopus japonicus)微卫星标记的开发与应用
仿刺参(Apostichopus japonicus)又名刺参,主要分布于我国北方、日本、朝鲜半岛及俄罗斯的远东地区,由于具有较高的食用和养生保健价值,迅速成为我国海水养殖的重要品种。培养抗逆性高、生长速度快的新品种是保持刺参养殖业健康与可持续性发展的有效途径,而飞速发展的分子标记辅助育种技术为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。本研究以仿刺参为主要研究材料,探讨了仿刺参微卫星标记的有效筛选方法及微卫星标记在仿刺参标记辅助育种中的应用。
1.仿刺参微卫星标记的筛选和评价
本研究利用EST文库筛查法和富集文库.菌落原位杂交法筛选得到了仿刺参的多个微卫星序列。利用至少48个仿刺参个体对全部位点进行了评价,结果共获得了276个多态性良好的微卫星标记。其中通过EST文库筛查法获得了59个多态性微卫星位点,不同的位点获得的等位基因数为2～10个不等,平均每个位点扩增得到4.8个等位基因,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.000～0.900和0.202～0.890;通过富集文库—菌落原位杂交法获得了217个多态性位点,全部位点获得的等位基因数目范围为2～15个,平均每个位点扩增得到6.8个等位基因,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.000～1.000和0.180～0.948。这些微卫星标记将成为仿刺参群体遗传学研究、微卫星遗传连锁图谱构建、经济性状的QTL定位和分子标记辅助选育等工作的有力工具。
2.全基因组扩增技术在仿刺参微卫星标记分型中的应用
在基因型的检测过程中,仿刺参幼虫由于个体大小的限制而无法为大量位点的PCR扩增提供足量的模板。为了解决这一问题,本实验采用MDA全基因组扩增技术对仿刺参耳状幼虫进行了全基因组扩增,并评价了此方法的扩增效率和保真性,为通过MDA方法从仿刺参幼虫中获得大量DNA以满足分子标记分析的需要做好了技术准备。选用了仿刺参一个F1代全同胞家系的2个亲本和30个处于大耳期的幼虫为实验材料,使用QIAGEN Repli-g UltraFast Mini Kit全基因组扩增试剂盒对子代幼虫进行全基因组扩增。琼脂糖凝胶电泳与紫外分光光度计检测显示,得到的基因组DNA片段较为完整,每次反应可以获得的DNA总量在1000ng左右。以这些DNA为模板,随机扩增了50对微卫星引物,获得了1500个基因型。与亲本基因型进行比对的结果显示,在1500个基因型中有7个基因型出现了错误,占全部基因型数目的0.47％。在错误的基因型中,有4个为等位基因增加、2个为等位基因丢失、1个为等位基因片段长度错误。本研究的结果表明,通过MDA技术对仿刺参幼虫进行扩增,可以得到优质、足量的DNA,这些DNA能够进一步的应用于微卫星标记的分析中。
3.微卫星标记在仿刺参家系鉴定中的应用
本研究使用多个微卫星标记,在仿刺参(9♀)×(1♂)、(10♀)×(10♂)两个关联家系中,对标记的亲子鉴定能力和亲子鉴定的准确率进行了研究。首先选择12个微卫星位点,对这两个家系的30个亲本在每个位点上的基因型进行了分析,将所获得的分型结果使用软件Cervus3.0进行了计算机模拟分析。模拟分析的结果显示,在子代两个亲本基因型都未知的情况下,全部12个位点的累计排除率(Exc11)为99.824％;在已知一个亲本基因型的情况下,全部12个位点的累计排除率(Exc12)为99.996％。在单位点排除率最高的7个位点组合时,Exc11和Exc12分别为99.016％和99.912％。在单独养殖的(9♀)×(1♂)家系中对这7个位点组合的准确率进行检验,鉴定结果与养殖记录比对显示,270个子代在父本已知、有9个候选母本的情况下,有264个子代个体找到了正确的母本,鉴定率为97.78％。在将这些微卫星标记应用于(10♀)×(10♂)混养家系时,在40个可能的亲本、500个子代个体中,93.8％的子代可以鉴定其父母本。本研究建立了一套适用于仿刺参的微卫星标记亲子鉴定体系,对选育中保持家系信息、确定亲缘关系、追踪家系提供了有力工具,为仿刺参的育种规划奠定了良好基础。
4.仿刺参微卫星连锁图谱的构建及生长相关性状QTLs定位的初步研究
为了加强仿刺参选育工作的有效性和准确性,真正在仿刺参中实现分子标记辅助选育,本文利用1个(9♀)×(1♂)的关联家系的F1子代和509个微卫星标记构建了仿刺参的雄性遗传连锁图谱。全部位点中共有298个可以用于父本作图,最终共193个标记被定位到框架图谱上,形成22个连锁群,图谱总长度为1905cM,标记的平均间隔为10.0cM。每个连锁群的长度在36.9cM和182.4cM之间,平均长度为86.6cM;连锁群的分子标记数最大为17个最小为4个,平均每个连锁群上含有8.7个标记。这是第一张以微卫星标记构建成的仿刺参遗传连锁图谱,该图谱的建立为进一步开展仿刺参QTL定位以及分子标记辅助育种奠定了基础。
仿刺参;辅助育种;微卫星标记;富集文库-菌落原位杂交;全基因组扩增;家系鉴定;遗传连锁图谱
中国海洋大学
博士
遗传学
包振民
2011
中文
S968.9
158
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）