高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究
从分离自海水、海泥、海鱼肠道与海藻的78株海洋酵母中筛选出7株高蛋白海洋酵母(hcx-2,L2-2,W1-6,Qme,SWJ-1b,W2B和Z1721-2),经测定它们的粗蛋白含量都超过了40.0％(w/w)。其中菌株SWJ-1b蛋白含量最高,达到47.6％(w/w),其细胞量(g/L)为6.7,其可作为潜在的单细胞蛋白使用。菌株SWJ-1b分离自鱼肠道。根据传统的鉴定方法、Biolog微生物自动分析系统鉴定及分子生物学鉴定,菌株SWJ-1b最终被鉴定为解脂耶罗维亚酵母菌(Yarrowialipolytica)。
利用表面展示系统对得到的高蛋白海洋Y.lipolytica菌株SWJ-1b进行了遗传改造。编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因被插入表面展示质粒pINA1317-Y1CWP110中,并在Y.lipolytica菌株SWJ-1b的尿嘧啶缺陷型中表达,EGFP被成功展示在酵母细胞表面,且发现100％的转化菌株细胞表面都展示有此锚定的目标蛋白。对海洋酵母Y.lipolytica SWJ-1b菌株,其尿嘧啶缺陷型菌株22a-2和筛选出的展示有EGFP的阳性转化子106进行了粗蛋白含量、细胞量、氨基酸含量、脂肪酸含量等营养组分分析,发现三者粗蛋白含量(w/w)分别为:54.9±1.3％、54.9±1.6％、51.1±0.8％,细胞量(g/L)分别为:12.0±0.1、12.0±0.2、16.0±0.1。三者氨基酸组分仍基本一致,特别是必需氨基酸,如赖氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸等。筛选的转化子106的C18:1和C18:3脂肪酸含量高于野生型SWJ-1b菌株,C16:0和C16:1脂肪酸含量低于SWJ-1b。表明海洋酵母SWJ-1b可经过基因改良锚定外源蛋白而且仍可进一步作为单细胞蛋白使用。
将编码来自栉孔扇贝(Chlamys farreri)组蛋白H2A N-端抗菌肽的DNA片段连接到表达质粒pINA1317中,在Y.lipolytica SWJ-1b菌株中表达。在PBB培养基中培养120h后,转化子Y1-H2A-29a产生了较多的抗菌肽,获得的上清对哈维氏弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌都具有抗菌活性。对三者最小抑菌浓度(μg ofprotein/mL)分别是4.47±0.4、8.95±1.4和1.12±0.2。对三者的抑菌圈直径分别为:14.0 mm、11.0mm和24.0 mm。然而我们发现上清对革兰氏阳性菌大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌活性。用Ni2+亲和层析纯化带有6×His标签的重组抗菌肽,纯化的重组抗菌肽分子量为4.5 kDa。透射电子显微镜观察发现,利用抗菌肽处理副溶血弧菌完整细胞和原生质体细胞后,抗菌肽造成了完整细胞和原生质体细胞的细胞内溶物泄露,并导致细胞死亡。这表明抗菌肽能够通过细胞外基质或细菌脂多糖、外膜和肽聚糖等不同屏障,在细胞膜上形成孔洞。SWISS模型分析表明抗菌肽中具有α螺旋结构,抗菌肽氨基酸的疏水性分布表明抗菌肽具有很多疏水性氨基酸,这可能和抗菌肽的抑菌活性机制相关。将已证实成功表达了抗菌肽基因的酵母转化子Y1-H2A-29a培养在YPD培养基,PPB培养基和含有硫酸铵的豆饼粉水解液中,经测定细胞蛋白含量(w/w)分别为48.9±0.3％、45.3±0.8％和46.1±1.4％,细胞干重(g/L)分别为12.0±0.9、11.5±0.7和9.9±0.6。能产生抗菌肽的Y.lipolytica SWJ-1b菌株仍能作为单细胞蛋白使用。这是关于利用高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母产生重组抗菌肽的首次报道。
将编码来自栉孔扇贝(Chlamys farreri)组蛋白H2A N-端的抗菌肽和编码菊粉酶基因INU1的DNA片段分别连接到表达质粒pINA1317中,并在Y.lipolyticaSWJ-1b中共表达。获得的重组产物对哈维氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌具备抑菌活性,对哈维氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌作用产生的抑菌圈直径分别为:12.0mm、8.0 mm和15.0mm,最小抑菌浓度(μg of protein/mL)为:6.28±0.2、13.63±0.4和2.51±0.7。对大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑菌活性。重组产物具备菊粉酶活性,菊粉酶活力为32.7±0.3 U/mL。使用2-L发酵罐发酵,发现发酵72 h重组产物菊粉酶活力最高,为38.6±0.4U/mL。此时发酵罐中的蛋白含量为46.3±0.2％,细胞干重为19.2±0.3 g/L。发酵培养120h重组产物的抑菌活性最强,对哈维氏弧菌、鳗弧菌、副溶血弧菌的抑菌圈直径分别为:13.0 mm、10.0 mm和16.0mm。
海洋酵母;抗菌肽;单细胞蛋白;遗传改良;菊粉酶
中国海洋大学
博士
微生物学
池振明
2011
中文
Q78
131
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）