壳聚糖基生物材料对角膜上皮层及内皮层损伤修复作用的研究
角膜是眼球最前部的突出部分,直接与外界环境相接,因而容易遭受外界的损伤。人眼角膜共分5层,角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。角膜上皮是最外层,发生机械性及化学性损伤的概率较高,损伤后可引起畏光流泪等症状,直接影响到患者的正常生活。采用药物治疗时,眼药水的渗透性增加,其含有的添加剂、防腐剂会加重药物的毒副作用,易导致角膜基质的溶解、继发感染,甚至穿孔,因此角膜上皮缺损后,能否迅速完整地促进创伤愈合,恢复角膜上皮细胞的屏障功能,是保持良好视力的关键。所以选择迅速有效促进角膜上皮再生的方法,对于角膜上皮机械性及化学性损伤的恢复具有重要的作用。
角膜内皮层在维持角膜的正常生理功能方面起着重要作用。人角膜内皮细胞在成年后几乎不进行有丝分裂,细胞密度随着年龄的增长逐渐减少,且角膜内皮对许多外界因素极为敏感,机械性创伤、化学品、药物和物理射线、眼科疾病等均能导致角膜内皮损伤。损伤后,角膜内皮细胞主要依靠邻近细胞扩张、移行来填补缺损区。当角膜内皮细胞密度小于临界细胞密度(400～500个/mm2)时,残存的内皮不能代偿,可导致角膜基质层水肿,角膜透明度下降,甚至致盲。角膜移植是目前恢复角膜透明性的主要治疗方法,但是同种异体角膜移植供体来源匮乏,还常伴有一定的免疫排斥反应,因此角膜内皮病的治疗是国际上的一项难题。
随着组织工程学的发展,应用组织工程化方法治疗角膜疾病成为研究的一个热点。壳聚糖是一种天然聚阳离子多糖,在医药、生物材料、食品、日用化工、生物工程和农业等领域都有较为广泛的研究和应用。壳聚糖具有可生物降解性、成膜性、成胶性、可促进伤口愈合等性质和功能,已成为多糖生物材料研究的热点之一。但是由于壳聚糖的水不溶性,以及降解过程中产生的颗粒物会伴随着一定的炎症反应,所以本研究以壳聚糖为基本材料,通过化学修饰改性旨在研究水溶性壳聚糖基生物材料在角膜损伤修复中的作用及应用。
本研究共为两部分:(一)首先制各了羟乙基壳聚糖(Hydroxyethyl chitosan,HECTS),对其基本性质进行了研究;并将其与明胶(Gelatin,Gel)和硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,Cs)按照一定比例共混,制备了壳聚糖基共混膜片,对该膜片的理化性质、细胞毒性、与角膜细胞的相容性、体外和体内的降解性等进行了研究,筛选出性质优异的膜片:将培养的角膜上皮细胞接种于筛选出的壳聚糖基共混膜片上,构建了组织工程角膜上皮,移植在机械损伤角膜上皮层的新西兰兔动物模型上,观察其修复效果。(二)制各羟丙基壳聚糖(HydroxypropylChitosan,HPCTS)-透明质酸(Hyaluronic acid,HA)复合水凝胶,对该水凝胶的细胞毒性、体内生物相容性和兔眼前房生物降解性等进行了评价;以该水凝胶为载体,包载体外培养的角膜内皮细胞移植在去除角膜内皮层的兔眼后弹力层上,观察对角膜内皮损伤模型的修复效果。
得到以下实验结果:
1、本研究制备的羟乙基壳聚糖具有良好水溶性;细胞毒性实验结果表明细胞毒性O-1级,属于无毒的生物材料;在一定浓度下对角膜上皮和内皮细胞的生长具有明显的促进作用。
2、将HECTS与CS和Gel按不同质量比例进行优化,制得共混膜片,具有高透明性,且1＃的透明性比2＃还要高,对NaCl和葡萄糖均具有良好的通透性;细胞毒性符合生物医用材料的标准;基质细胞和内皮细胞都能在膜片上生长且形成良好的单层,膜片经大鼠肌肉内植入试验以评价材料的生物相容性和生物降解性,结果表明,膜片在肌肉内稳定降解且不产生“包囊"现象,与不可降解的手术缝合线相比较,产生的炎症反应较轻;将共混膜片植入兔眼前房内,发现膜片能够缓慢地降解且不产生明显的炎症反应,为下一步组织工程化角膜的体外构建及移植实验的继续深入研究提供了良好的实验依据。
3、将体外培养了角膜上皮细胞接种于共混膜上,上皮细胞能够在膜片上贴附生长并彼此连接成片层,细胞状态良好;将载有上皮细胞的共混膜片用于严重机械损伤的兔角膜上皮层上,结果表明实验组的修复创面时间要比对照组缩短了一半,修复效果具有统计学意义。
4、羟丙基壳聚糖与透明质酸可以通过电荷作用形成多糖水凝胶,细胞毒性评价为0级;凝胶在肌肉组织中的降解性研究表明,早期出现一定的炎症反应,20d时随着材料的大部分降解炎症反应明显消退。
5、以多糖水凝胶为载体,将兔角膜内皮细胞固定化移植在已除去角膜内皮层的异体兔眼后弹力层上,术后通过外眼像观察、扫描电镜、组织学观察以及裂隙灯观察均得出一致的结果,即75d时观察到实验组已形成了良好的角膜内皮层,角膜薄而透明,移植上的角膜内皮细胞状态良好与正常兔角膜内皮细胞基本保持一致,90d时,实验组兔眼已基本恢复正常;损伤对照组角膜厚而混浊,裂隙灯观察角膜仍保持混浊不透明,说明本实验建立的内皮损伤模型很成功,采用的凝胶包载角膜内皮细胞行角膜内皮层的原位修复方法有效。
总之,本文研究的壳聚糖基生物材料作为细胞载体,对兔角膜上皮机械损伤和角膜内皮层损伤的原位修复具有明显的治疗效果,为今后角膜组织工程方法治疗角膜疾病的研究提供了实验依据。
水溶性壳聚糖;角膜细胞载体;水凝胶;细胞移植;角膜疾病
中国海洋大学
博士
海洋生物学
刘万顺
2011
中文
R772.2;R318.08
137
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）