基于液质联用技术的马粪海胆、柄海鞘指纹图谱及活性成分筛选方法研究
近年来,现代分析技术尤其是液相色谱.质谱联用(LC-MS)技术得到了迅速发展。其在天然药物化学、药物分析、药物筛选、中药现代化等领域的广泛应用均极大地促进了相关学科的发展。本文采用LC-MS联用技术,以马粪海胆、柄海鞘等海洋药用生物为研究对象,发展了基于液质联用技术的海洋药用生物指纹图谱、核苷类化合物测定、抗氧化活性成分和乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选新方法,为我国海洋药用生物的真伪鉴别和活性成分快速发现研究提供了方法学参考。主要研究内容及结果简述如下:
1.将高效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术用于两种海洋药用生物马粪海胆和柄海鞘的真伪鉴别。首先,发展了马粪海胆和柄海鞘HPLC指纹图谱分析方法,在本文优化的色谱条件下,两种海洋药用生物提取物中各化合物分离良好。方法学考查结果表明,两种方法均具有较好的精密度、重现性和稳定性,可以满足指纹图谱的要求。通过对多批次马粪海胆和柄海鞘样品进行分析,分别构建了马粪海胆和柄海鞘的HPLC特征指纹图谱,结合相似度分析成功实现了对两种海洋药用生物的真伪鉴别。说明HPLC指纹图谱法是马粪海胆和柄海鞘真伪鉴别的有效方法。
2.首次建立了亲水色谱-电喷雾飞行时间质谱法(HILIC-ESI-TOF/MS)测定柄海鞘、马粪海胆等海洋药用生物中16种核苷类化合物(包括:腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、肌苷、腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷、尿苷、2'-脱氧鸟苷、2'-脱氧胞苷、2'-脱氧腺苷)的方法,并在此基础上探索性的发展了基于16种核苷类化合物分布特征的海洋药用生物指纹图谱新方法。采用HILIC-ESI-TOF/MS测定海洋药用生物中核苷类化合物,在本文优化的仪器条件下,各核苷类化合物分离良好,采用ESI-TOF/MS为检测器相对于紫外检测器具有更高的灵敏度和选择性,可以实现对海洋药用生物复杂基质中微量核苷类化合物的准确定性、定量。柄海鞘、马粪海胆等海洋药用生物中核苷类化合物的测定结果表明,同一种海洋药用生物中各核苷类化合物含量相似,不同海洋药用生物中各核苷类化合物含量存在显著不同。另外,采用基于16种核苷类化合物的指纹图谱,结合相似度分析和聚类分析,用于不同海洋动物药的鉴别。结果表明,基于核苷类化合物的指纹图谱能反映不同海洋动物药各自的固有特征,结合相似度分析和聚类分析,可实现对不同海洋动物药的正确区分。说明核苷类化合物指纹图谱有望成为海洋药用动物鉴别的新方法。
3.发展了1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除活性评价结合LC-MS筛选、鉴别海洋药用生物中抗氧化成分的方法,并应用于马粪海胆中抗氧化成分的筛选和鉴别。首先,利用DPPH自由基清除活性评价实验,对马粪海胆不同溶剂提取物的自由基清除活性进行比较,结果表明,马粪海胆水提物的自由基清除活性最好,潜在抗氧化能力最强。其次,建立了基于自由基清除剂色谱峰变化的DPPH-HPLC抗氧化成分筛选方法,结合ESI-TOF-MS分析,可实现对海洋药用生物粗提物中抗氧化成分的快速筛选和鉴别。结果在马粪海胆水提物中筛选到9种抗氧化成分,根据测得各化合物的质谱信息、UV图,结合数据库对其进行了初步鉴定。另外,对马粪海胆壳的乙醚提取物中的抗氧化成分也进行了筛选,发现了4种弱极性抗氧化成分,采用大气压化学电离飞行时间质谱(APCI-TOF/MS)分析,获得了各化合物的精确分子量信息,结合文献和数据库鉴定为4种萘醌类色素。综上可以看出,本文发展的DPPH自由基清除活性评价结合LC-MS分析筛选、鉴别海洋药用生物中抗氧化成分的方法,集活性筛选、质谱鉴别于一体,相比于传统方法效率高、速度快,为海洋药用生物中抗氧化活性成分的快速筛选、鉴别提供了方法支持。
4.建立了亲和超滤.液相色谱质谱联用技术(AS/UF-LC-MS)快速筛选、鉴别海洋药用生物中乙酰胆碱酯酶抑制剂的新方法。首先,采用酶抑制活性评价实验对马粪海胆、柄海鞘不同溶剂提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了比较,结果表明,柄海鞘乙酸乙酯提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性最强。其次,对孵化条件进行了系统优化,在此基础上建立了AS/UF-HPLC-ESI-TOF/MS筛选、鉴别乙酰胆碱酯酶抑制剂的方法。最后,采用本研究发展的方法,对柄海鞘乙酸乙酯提取物中添加的他克林(乙酰胆碱酯酶抑制剂)进行筛选,结果表明,采用该方法能成功筛选出他克林。说明本文发展的AS/UF-LC-MS方法适用性强,是海洋天然产物复杂体系中乙酰胆碱酯酶抑制剂快速发现的有效方法。
海洋药用生物;马粪海胆;柄海鞘;指纹图谱;抗氧化;液质联用;活性成分
中国海洋大学
博士
海洋化学
王小如
2011
中文
R282.77;O657.63
169
2011-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）