O-GlcNAc糖基化修饰在肿瘤发生与转移过程中的作用及其机制研究
1984年,Torres和Hart发现细胞质和细胞核中蛋白质的丝氨酸和苏氨酸上存在O连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)单糖修饰。O-GlcNAc修饰基团添加和移除分别由糖基转移酶(O-GlcNActransferase,OGT;EC2.4.1.94;GI:6006036)和糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA;EC3.2.1.52;GI:13646137)完成。到目前为止,已发现超过1000种蛋白质被O-GlcNAc糖基化修饰,O-GlcNAc修饰影响蛋白质相互作用、细胞定位、蛋白降解并参与各种生物学功能的调节。O-GlcNAc修饰在Ⅱ型糖尿病、神经性退行性疾病和心脑血管疾病中的作用都已给予了广泛而深入的研究,本论文对O-GlcNAc修饰在肿瘤发生与发展过程中作用及其机理的研究,填补了该领域研究空白。以人类最普遍的乳腺癌和肺癌为例,本论文系统研究了O-GlcNAc糖基化修饰对癌症发生与转移的作用及其机制。
首先,对31例病人乳腺癌及其匹配的癌旁组织用O-GlcNAc抗体进行免疫染色,结果显示乳腺癌的细胞核及细胞质中O-GlcNAc修饰水平都显著高于其对应的癌旁组织。同时,对31例病人肺癌及其匹配的癌旁组织进行免疫染色,结果显示肺癌的细胞核及细胞质中O-GlcNAc修饰水平都显著高于其对应的癌旁组织。上述结果表明O-GlcNAc修饰水平与肿瘤发生有正相关性,暗示O-GlcNAc修饰可能在肿瘤的发生与转移过程中发挥重要作用。
其次,对O-GlcNAc修饰在肿瘤发生和转移过程中发挥的作用进行研究。以人和小鼠的代表性乳腺癌和肺癌细胞株为研究对象,利用慢病毒载体通过RNAi技术构建了O-GleNAc修饰降低的稳定细胞株;用OGA特异性抑制剂PUGNAc处理得到O-GlcNAc修饰增加的细胞模型。在体外,采用上述细胞模型进行了O-GlcNAc修饰对肿瘤细胞生物行为学的研究:O-GlcNAc修饰对乳腺癌和肺癌细胞的增殖无明显影响但显著增强了肿瘤细胞克隆形成能力;O-GlcNAc修饰抑制肿瘤细胞之间黏附,使肿瘤细胞更容易分散;O-GlcNAc修饰显著促进肿瘤细胞在Transwell小室中的迁移能力。在体内,利用小鼠乳腺癌转移模型研究了O-GlcNAc修饰对肿瘤发生与肺转移能力的影响,结果显示O-GlcNAc修饰对小鼠乳腺癌原位瘤的生长没有影响,但显著促进了肺部转移结节数,促进了乳腺癌的肺转移能力。通过体外体内实验同时证明,O-GlcNAc修饰对肿瘤的发生与转移有重要促进作用。
再次,为了阐明O-GlcNAc修饰促进肿瘤发生和转移的分子机制,我们对影响肿瘤发生与转移的经典信号通路进行检测,发现O-GlcNAc修饰抑制了细胞黏附因子E-cadherin的表达。E-cadherin是胚胎发生与发育过程中的关键调控因子,尤其在肿瘤的发生和转移过程中也发挥重要作用。通过RNAi技术,沉默肿瘤细胞中E-cadherin表达,促进了肿瘤细胞体外迁移能力;在此基础上,通过OGT和E-cadherin双干扰技术和OGA抑制剂处理两种手段同时证明了E-cadherin介导了O-GlcNAc修饰对肿瘤细胞体外迁移能力的促进作用;在体内,利用小鼠模型同样证实了E-cadherin介导O-GlcNAc修饰对小鼠肺转移能力的促进作用。因此,体内体外实验同时证明E-cadherin表达抑制是O-GlcNAc修饰促进肿瘤发生和转移的重要机制。
最后,我们又进一步探究了O-GlcNAc修饰抑制E-cadherin表达的机理。定量PCR技术检测发现O-GlcNA修饰c对E-cadherin的mRNA水平几乎没有影响;半衰期实验证实O-GlcNAc修饰加速了E-cadherin蛋白的降解,因此,O-GlcNAc修饰降低E-cadherin表达是通过促进E-cadherin降解实现的。我们对E-cadherin进行了O-GlcNAc修饰检测,结果表明E-cadherin没有O-GlcNAc修饰,并且改变细胞中O-GlcNAc修饰水平对E-cadherin的丝氨酸和酪氨酸磷酸化都没有影响。因此,并不是O-GlcNAc修饰对E-cadherin的直接修饰促进其降解。在免疫共沉淀实验中发现O-GlcNAc修饰抑制了E-cadherin和p120相互作用,并且前人研究已证明p120蛋白具有稳定E-cadherin的作用,所以我们对p120蛋白进行了O-GlcNAc修饰的检测,并首次证明P120蛋白具有O-GlcNAc修饰,所以推测p120的O-GlcNAc修饰抑制了其与E-eadherin的结合,从而促进E-cadherin的降解。
综上所述,本论文以乳腺癌和肺癌为研究对象,在国际上首次证明O-GlcNAc修饰促进肿瘤发生和转移,并阐明了其分子机制;通过对病人乳腺癌和肺癌组织检测,证明肿瘤发生和转移过程中O-GlcNAc修饰增加。该研究为确立O-GlcNAc修饰作为肿瘤诊断和治疗的新靶点提供了科学依据,还将为阐明肿瘤的发病机制提供新的重要信息。
乳腺癌;肺癌;糖基化修饰;分子机制;发病机制
中国海洋大学
博士
生药学
于文功
2011
中文
R730.2
128
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）