斑马鱼缺氧诱导因子-3α的克隆、表达和功能研究
缺氧在胚胎发育、生理和病理反应中起着重要作用。机体和细胞为应对缺氧胁迫,形成了大量蛋白参与的,精巧、复杂的反应机制。在整个应答体系中,缺氧诱导因子(HIF)是最关键的调控者,居于核心位置。HIF家族包括HIF-1,-2和-3三个成员;每个成员都含有受氧调控的a亚基(HIF-1a,-2a和-3a)和组成性表达的B亚基。目前,我们对HIF家族的认识主要来自HIF-1a和HIF-2a,对HIF-3a却知之甚少。本研究克隆得到斑马鱼hif-3a,通过体内、体外实验,首次证实Hif-3a是转录因子,同时发现一个不受氧气调控的Hif-3a转录本(H3-513)并研究它的活性位点和体内功能。
本研究从模式生物斑马鱼中克隆得到hif-3a基因,它位于15号染色体,cDNA全长2,196 bp,ORF为1,881 bp,含15个外显子,编码626个氨基酸。与HIF-1a相比,Hif-3a含有N-端保守结构域(bHLH和PAS)和氧应答结构域ODD,缺失C-端C-TAD结构域,新增LZIP结构域。斑马鱼hif-3a呈现全身性表达模式,在胚胎发育初期含量很低,从4 hpf开始有明显表达,随后逐渐升高并维持在稳定水平;在成鱼肾脏和卵巢中hif-3a表达最高,脑、鳃、脾脏、心脏、肠胃和精巢都有明显表达。转录水平,hif-3a mRNA的表达受氧气浓度调控,成鱼或胚胎经过缺氧处理后,hif-3a mRNA显著升高。翻译水平,Hif-3a也受氧气调控,ODD结构域中两个保守脯氨酸基序介导了Hif-3a常氧条件下的降解,点突变该基序核心氨基酸后,斑马鱼Hif-3a的蛋白水平和活性都显著提高。
亚细胞定位显示Hif-3a是核蛋白,说明Hif-3a具有作为转录因子的特征。本研究从体外和体内两个层面,证明Hif-3a,是转录因子。首先,利用荧光素酶报告体系,发现斑马鱼Hif-3a能显著促进报告基因p2.1的表达;Hif-3a与dominant negative Hif-3a(dnHif-3a)共转染,则抑制报告基因的表达,这说明Hif-3a在体外细胞系中具有转录活性。向胚胎显微注射Hif-3a mRNA,能显著上调报告基因,同时发现,内源基因igfbp-16和rtp801的表达水平也明显上升;将dnHif-3a与Hif-3a共注射胚胎,则检测不到igfbp-1b和rtp801的变化;注射dnHif-3a,能抑制缺氧对igfbp-16和rtp801的上调作用;这表明Hif-3a能够作为转录因子调节内源基因的表达,是转录因子。此外,实验显示Hif-3a具有独立的转录活性,且不影响Hif-1a活性。
本研究还克隆得到斑马鱼Hif-3a一个新的转录本H3-513。它的ORF长513bp,含5个外显子,编码170个氨基酸,包括TAD和LZIP两个结构域,在时空表达模式上与Hif-3a类似。qRT-PCR检测发现,缺氧处理成鱼和胚胎,不影响h3-513 mRNA的表达;常氧下H3-513的蛋白稳定存在,表明H3-513的mRNA和蛋白都不受氧气调控。无论在细胞系还是活体胚胎细胞,H3-513都定位在细胞核中。体外转染不同细胞系,H3-513均能促进报告基因表达;胚胎注射H3-513mRNA显著增强内源基因igfbp-1a的表达,说明H3-513具有转录活性;通过删除突变证实,TAD结构域中保守的脯氨酸残基(Pro37)决定着H3-513的活性。过量表达H3-513导致胚胎出现一系列畸形,这说明它在体内具有重要作用。本研究克隆得到斑马鱼Hif-3a并证明它是转录因子;首次发现不受氧气调控的HIF-a蛋白-H3-513。这些结果为深入研究Hif-3a的功能奠定基础,对全面认识和理解HIF-a,家族具有重要价值。
缺氧诱导因子-3a;转录因子;基因表达;斑马鱼;活性位点
中国海洋大学
博士
生药学
段存明
2011
中文
Q786
131
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）