海参皂苷echinosideA和ds-echinoside A抗肿瘤活性及其作用机制的研究
海参皂苷是海参体壁中重要的活性成分之一,具有抗真菌、抗病毒、调节脂质代谢、免疫调节等广泛的药理活性。不同种类的海参因生活环境和摄食不同,其体内皂苷含量和结构差别较大。通过前期筛选发现一种皂苷含量丰富的海参一革皮氏海参(Pearsonothuria graeffei),其体壁海参皂苷的含量可达干重的3.514％,可以作为海参皂苷良好的生物来源。本实验利用从革皮氏海参中经大孔树脂、反复正反相硅胶柱层析、高效液相分离得到的三萜皂苷化合物echinoside A(EA)和ds-echinoside A(DSEA)为研究对象,在体内和体外水平系统评价了EA和DSEA抗肿瘤活性及其作用机制,并对其构效关系进行了初步探讨。主要研究结果如下:
采用MTT法对EA和DSEA的体外抗肿瘤活性进行了筛选。结果显示,EA和DSEA对HepG2、B16、Caco-2、Hela、P388、S180等多种肿瘤细胞有广泛的增殖抑制活性(P＜0.01),且有明显的时间效应和剂量效应关系。在选用的肿瘤细胞株中,EA和DSEA对HepG2细胞作用最敏感,24h时IC50值分别为2.49μM和2.46μM。
基于筛选结果,以HepG2细胞为研究对象,采用形态学观察、AO/EB染色法、流式细胞术对EA和DSEA体外抗肿瘤生长活性及其可能机制进行了探讨。结果表明,EA和DSEA均能抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,改变肿瘤细胞周期分布,形成G0/G1期阻滞。RT-PCR结果显示,EA和DSEA能显著下调Cyclin D1 mRNA表达,提高p16、p21和C-myc mRNA表达。Western blotting实验表明EA和DSEA能显著下调Bcl-2蛋白表达,提高线粒体细胞色素C的释放量,上调Caspase-3和PARP剪切体的表达量。对于NF-κB,DSEA能显著降低其蛋白的表达,但EA对其表达无显著影响。提示EA和DSEA具有显著抑制肿瘤细胞生长的活性,其作用机制与抑制Cyclin D1/CDK结合,阻滞细胞周期,并通过线粒体信号通路启动肿瘤细胞凋亡相关。
比较研究了EA和DSEA抗HepG2细胞转移的活性及其作用机制。结果表明,EA和DSEA均可显著抑制肿瘤细胞迁移(P＜0.05,P＜0.01)、粘附(P＜0.05,P＜0.01)和侵袭能力(P＜0.01)。免疫细胞化学染色结果显示,EA和DSEA均可下调MMP-9并提高TIMP-1的表达。Western blotting结果表明,EA和DSEA均可显著下调VEGF蛋白的表达。提示EA和DSEA可通过调控MMP-9信号通路抑制HepG2细胞转移。
为深入探讨EA和DSEA抗肿瘤转移作用及其机制,进一步选用高转移细胞株.人肺巨细胞癌95D为研究对象,比较研究了EA和DSEA对95D细胞迁移、粘附、侵袭和血管新生各环节的作用及其机制。结果表明,EA和DSEA能显著降低95D细胞迁移(P＜0.01)、侵袭(P＜0.01)以及粘附能力(P＜0.05,P＜0.01);还能显著抑制血管内皮细胞增殖,促进血管内皮细胞的凋亡,抑制内皮细胞小管的形成和Chicken Chorioallantoic Membrane(CAM)上的血管新生。RT-PCR结果显示,EA和DSEA能显著降低uPA、MMP-2/-9和VEGF的表达,同时还能显著上调TIMP-1/-2的表达。对于NF-κB,DSEA能显著降低其mRNA的表达,但EA对其表达无显著影响。提示EA和DSEA可通过调控uPA信号通路,保护ECM结构,减少VEGF的释放,从而抑制95D细胞转移。
通过建立小鼠Lewis肺癌自发肺转移模型和B16人工肺转移模型,在整体水平验证EA和DSEA的抗肿瘤作用,并对其机制进行探讨。Lewis肺癌自发肺转移模型结果显示,EA和DSEA能显著抑制Lewis肺癌实体瘤的生长和肺转移,上调Caspas-3的表达,下调HPA、MMPs和VEGF的表达。提示EA和DSEA可能通过诱导肿瘤细胞凋亡,降低ECM降解酶的活力,减少VEGF的释放,抑制肿瘤的转移。B16人工肺转移模型结果显示,EA和DSEA能显著减少B16肺转移灶的数目,降低血清中SA含量和γ-GT活力以及肺组织中羟脯氨酸、氨基己糖和糖醛酸含量,抑制黑色素瘤细胞的增殖活性和运动性,从而显著的抑制肿瘤细胞通过血液循环引发的转移。
EA和DSEA均属于具有9(11)位双键和12,17位羟基取代的海参烷型三萜皂苷,其苷元部分结构完全相同,仅在糖链部分略有差别。EA在木糖(Xyl)的C-4位上有硫酸酯基取代,而DSEA则在Xyl C-4发生了脱硫酸酯基的现象。本实验结果显示,DSEA抗肿瘤作用高于EA,这表明在Xyl C-4上脱硫酸基反应可能会提高皂苷的抗肿瘤活性。
本论文首次系统研究了海参皂苷EA和DSEA体内体外抗肿瘤活性,初步阐明EA和DSEA抑制肿瘤生长、转移和血管新生的机制,探讨了其构效关系,为深入挖掘海参皂苷的药用价值,推动革皮氏海参高值化加工利用以及新型抗肿瘤功能性食品的开发提供了理论研究基础和科学依据。
海参皂苷;抗肿瘤活性;构效关系;肺癌;自发肺转移;动物模型
中国海洋大学
博士
水产品加工与贮藏
薛长湖;王静凤
2011
中文
R285.5;R734.2
139
2011-11-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）