鳕鱼免疫活性肽的可控制备及其免疫活性研究
免疫活性肽是一类具有增强机体免疫力、增强巨噬细胞吞噬功能、提高机体抵御外界病原体感染能力等免疫功能的肽,具有分子量小、稳定性强,且免疫原性弱、生物活性高等诸多优点。目前酶法制备生物活性肽主要集中在活性优化和动力学模拟上,并不能保证酶解按预期进行。而鳕鱼免疫活性肽的可控制备及免疫活性研究,是通过采用生物技术、生物传感器、数学模型、人工神经网络等实现了免疫活性肽的准确预测、动态监测、可控制备,并且利用树脂吸附技术等对免疫活性肽精制,为免疫活性肽的工业化生产提供理论依据和技术支持。同时本文还对制备的鳕鱼免疫肽的体内免疫活性机理作了初步探讨。
本论文形成了以下研究成果:
1、本文以鳕鱼加工下脚料鳕鱼排为原料作为研究对象,首先研究了其基本组成。鳕鱼排中蛋白质含量较高(18.4％),以碱溶性蛋白(35.49％)和基质蛋白(30.49％)为主,有重要利用价值。鳕鱼排蛋白中以高含量的甘氨酸(26.51％)和谷氨酸(12.57％)为主,其次为丙氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、亮氨酸和赖氨酸。为了充分利用鳕鱼蛋白,对鳕鱼排进行了软化高压预处理研究,条件最终设定为120℃处理30min。
2、水解度值、分子量分布、多肽含量均是反映酶解产物特征的重要因素,但在线监测困难。鳕鱼蛋白酶解产物游离氨基酸含量呈现规律性变化,可作为监测水解反应的响应因子,并且生物传感器测定响应因子速度快、准确度高、稳定性好。其中对谷氨酸和赖氨酸测定的相对误差分别为1.5％和1.0％,变异系数分别为3.85％和3.03％,标准偏差分别为0.78和0.60。多酶切位点下,游离谷氨酸和赖氨酸都呈规律性变化,与水解度正相关,可作为酶解产物的响应因子,同时在一定水解度范围内,游离谷氨酸和赖氨酸浓度与水解度均呈现较好的线性关系。利用游离谷氨酸和赖氨酸浓度作为响应因子监测多种商品酶的水解程度是可行的。
3、鳕鱼排的胰酶水解产物(PFH)可以显著促进脾细胞增殖、T细胞增殖、巨噬细胞吞噬(p＜0.05)。分子量和水解度是影响脾细胞增殖活性的重要因素。在水解度15-18％时,PFH的脾细胞增殖活性最高。采用响应面方法确定了鳕鱼免疫肽制备参数:蛋白浓度25ge/L、pH值8.0、温度(50±1)℃、时间290 min和加酶量24 U/mg,验证实验的平均DH为16.87％,脾淋巴细胞平均增殖率为28.45％,与理论值相符。PFH在220hm和280nm处有较大吸收峰,氨基酸组成以脯氨酸(15.69％)含量最高。PFH在广泛的pH范围具有较好的溶解性,在温度20-60℃范围PFH具有较低的粘度;pH对PFH的起泡性、乳化性影响较大。PFH在胃蛋白酶、胰蛋白酶和复合酶条件下会发生部分降解,但主要多肽成分的变化很小。
4、在严格控制水解条件下,动力学模型在一定范围内可以很好的预测反应的进行。鳕鱼蛋白的胰酶水解的动力学模型为:R=(0.1693 E0-0.2816 S0)exp|-0.357*DH|,DH=2.801 ln|1+(0.06044 E0/S0-0.1005)t|,胰蛋白酶的失活动力学常数为0.0512 min-1。鳕鱼免疫肽恒定条件时的预测模型:DH=2.801 ln[1+1.35006t],可以通过预测曲线,获得免疫肽的制备时间。这对鳕鱼免疫活性肽制备有十分重要的意义。验证试验表明,当条件恒定时,实现了鳕鱼免疫肽制备的预测性,且模型理论值与实际值相符。但是当条件改变时,如搅拌速率的变化、温度的波动,显著的影响了最终反应产物,模型理论值与实际值不符。
5、利用生物传感器,实现了恒定条件和动态条件下鳕鱼免疫制备的监控。恒定条件下,水解度在11-18％时,与游离赖氨酸、谷氨酸呈现很好的线性关系,方程式分别为:DH=0.2225[Glu]-5.3097,DH=0.0126[Lys]-1.2275。当初始酶浓度或初始底物浓度改变时,谷氨酸、赖氨酸的响应浓度与水解度数学关系不明确,呈现无规律的曲线关系。尽管不能用统一的数学模型确定动态变化的水解反应,但是其反应临界值符合很好的的线性关系,可以用以下公式来表示:[Glu]=0.8186[S0]+0.0346[E0]+0.4506,[Lys]=0.7430[S0]+0.1370[E0]+5.2931。
6、本文利用人工神经网络(BP-ANNs)和生物传感器,建立了三个可在动态变化条件下实现在线监测的网络模型分别为:GLU-BP-ANNs的动态监控模型,LYS-BP-ANNs的动态监控模型,GLU-LYS-BP-ANNs的动态监控模型。三个模型的样本值与拟合值进行比较分析可知,R2值分别为0.9967、0.9964、0.9967,拟合误差范围分别为0-4.14％、0-4.56％、0-4.71％,拟合平均相对误差值分别为1.06％、0.94％、0.99％。利用模型进行五次独立的验证实验,理论值与实验值相符合,试验的相对误差范围分别为0.23％-2.81％,0.26％-1.91％和0.30％-2.35％。三个模型在一定程度上实现了仿真监控,均可以用来监测水解反应的进程。三个网络监控模型的共性参数如下:隐含层为1层,输入层与隐层之间使用logsig传递函数,隐层与输出层之间使用线性purelin函数,网络训练函数采用trainlm,适应性学习函数采用learngdm。GLU-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、游离谷氨酸浓度[Glu];输出层节点为DH:隐层节点数为10。LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的赖氨酸浓度[LyS];输出层节点为DH:隐层节点数为11。GLU-LYS-BP-ANNs模型确定的其他参数如下:输入层节点分别为初始酶浓度E0、初始底物浓度S0、终产物的[Lys]和[Glu];输出层节点为DH;隐层节点数为8。
7、利用Sephadex G-25凝胶柱层析、阳离子色谱、反相高效液相色谱对鳕鱼免疫肽混合成分反复纯化,获得了三个免疫活性肽,并利用反相高效液相色谱C18分析柱纯度鉴定,得到单一对称的单峰。利用Nano-ESI-Ms/Ms分别对三个活性肽进行结构表征。免疫肽Y3的分子量为583.9922Da,为五肽,肽序列为Asn-Gly-Met-Thr-Tyr,在20μg/mL时的脾细胞平均增殖率分别为35.92％。免疫肽H2的分子量为470.1422Da,其肽序列为Asn-Gly-Leu-Ala-Pro,为五肽,在浓度20μg/mL时,脾淋巴细胞增值率平均值为32.96％。免疫活性肽S4的分子量为305.1622Da,为二肽,其序列为Trp-Thr,在浓度20μg/mL时,脾淋巴细胞增值率平均值为31.35％。
8、本文进一步研究了PFH对正常小鼠、免疫低下小鼠的免疫机理。PFH能显著提高正常小鼠的淋巴细胞转化活性(p＜0.05)、迟发型变态反应(p＜0.05)和单核巨噬细胞的吞噬能力(p＜0.05),而对免疫器官指数和血清溶血素的影响较小(p＞0.05)。对于免疫功能低下小鼠,PFH能显著提高小鼠的免疫器官指数(P＜0.05);显著促进小鼠的迟发型变态反应(p＜0.05),提高小鼠脾淋巴细胞的增殖能力(P＜0.05),提高小鼠的细胞免疫功能:提高血清溶血素含量(P＜0.05),促进小鼠的体液免疫功能;显著促进小鼠的碳廓清能力(P＜0.01)和腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数(P＜0.05,P＜0.01),促进小鼠的非特异性免疫功能。
9、在免疫肽的精制中,DA201-C树脂对PFH的吸附能力最强,静态吸附最佳条件为:温度25℃,pH4.0,多肽浓度10 mg/mL,树脂质量与多肽体积比(g/mL)2:1,吸附时间3 h,吸附率可达84.7％。乙醇浓度为50％(φ)时,静态解析率最高为82.7％。动态吸附与解析得到的脱盐多肽,脱盐率为98.1％,多肽回收率为90.3％。脾细胞增殖实验表明DA201-C树脂脱盐后的多肽仍具有促进脾细胞增殖活性。
鳕鱼;可控酶解;免疫活性肽;生物传感器;免疫活性
中国海洋大学
博士
食品科学
李八方
2011
中文
S917.4
216
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）