海带低分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备及其抗血栓活性研究
我国每年心血管疾病死亡者占因病死亡总人数的40.7％。其比例远高于人类大敌癌症,居各类死因之首,而血栓形成为其主要因素。因此,开发天然、高效、毒副作用小的抗血栓药物成为当今医药领域研究的重点。
岩藻聚糖硫酸酯是是褐藻中特有的一种含有硫酸酯的水溶性杂聚糖,化学组成和结构随海藻的种类、生长季节和提取方法的不同而不同。目前对羊栖菜、泡叶藻、昆布等制备的岩藻聚糖硫酸酯的研究较多,但关于海带中岩藻聚糖硫酸酯的研究大多为大分子的杂多糖,结构不清楚,无法解释作用机理,所以有必要对我国海域内生长的海带中的岩藻聚糖硫酸酯进行结构的深入分析,并联系其抗血栓活性,进行构效关系的研究,本文主要从以下两个方面进行研究:
一、以我国黄海海域生长的海带提取的岩藻聚糖硫酸酯粗糖为原料,用Q-Sepharose FF阴离子交换分离纯化得到中分子量岩藻聚糖硫酸酯,自由基氧化降解法得到低分子量的岩藻聚糖硫酸酯,在不同分子量岩藻聚糖硫酸酯的制备和化学分析过程中,我们对不同制备条件下所得产物的得率、分子量分布、硫酸根含量、中性糖组成及官能团进行了分析,对测定硫酸根的传统氯化钡-明胶法进行了改进并将改进后的方法与离子色谱法进行对比,得出一种适合在海带岩藻聚糖硫酸酯中测定硫酸根含量的最佳方法。具体结果如下:
1)通过Q-Sepharos FF阴离子交换制备得到中分子量岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量和数均分子量为F1:28000和19000,F2:35000和28000。硫酸根含量为9.52％和19.87％.硫酸根连接在糖的C2或C3位处于平伏键位置。F2硫酸根含量最高,主要含有岩藻糖和半乳糖。
2)自由基降解海带岩藻聚糖硫酸酯粗糖时,9％H2O2和4.5％H2O2氧化降解所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在300-2500Da内的组分无显著差别,分子量为1.5kDa,组分集中。4.5％H2O2氧化降解粗糖所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在6000-10000Da之间的组分分布集中,重均和数均分子量分别为7900和7600。2500-6000Da之间的组分得率最高,大于30％,重均和数均分子量分别为3500和2800,分子量分布比6000-10000Da组分宽。9％H2O2氧化降解粗糖得到的低分子量糖的硫酸根含量明显低于4.5％的H2O2。在6000-10000Da之间的降解产物得率很少,小于1％。产物主要集中在2500-6000Da。4.5％H2O2氧化降解4.5g粗糖所得的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在2500-10000Da内的组分LMWF4硫酸根含量最高,为30.28％。将其用6KDa的超滤膜分离后得到3.31KDa的LMWF4a和7.74KDa的LMWF4b,硫酸根含量分别为32.48％和30.32％。LMWF4b主要含有岩藻糖和半乳糖,比例是2:1。LMWF4a的岩藻糖低于LMWF4b,半乳糖、葡萄糖和甘露糖含量升高。降解后的低分子量岩藻聚糖硫酸酯在820cm-1处有的吸收峰,有可能在C2和C4之间形成双硫取代。说明自由基氧化降解岩藻聚糖硫酸酯,过氧化氢浓度越高,产物的分子量越低,产物的硫酸根和岩藻糖的含量也会下降。
3)实验中发现氯化钡-明胶溶液不稳定和溶液中存在的大量气泡是造成传统氯化钡-明胶法测定硫酸根含量稳定性差、精密度低的两个重要原因,因此采用加热溶剂和脱气法对传统氯化钡-明胶法进行改进。改进后的氯化钡-明胶法相关系数为0.9991,比传统氯化钡一明胶法的相关系数明显提高,说明改进后的氯化钡-明胶法精密度高,稳定可靠,并且实验试剂和仪器成本低,适合普通实验室和化验室测定海带岩藻聚糖硫酸酯中硫酸根含量的使用;而离子色谱法在测定海带岩藻聚糖硫酸酯中硫酸根的含量时比氯化钡-明胶法所需样品少,不受其他离子及杂质的干扰。利用F检验,发现离子色谱法在测定海带岩藻聚糖硫酸酯硫酸根时的精密度比改进后的氯化钡-明胶法更高,操作简便、快捷,适合在海带岩藻聚糖硫酸酯的硫酸根含量的检测中推广。
二、利用制备出的中分子量岩藻聚糖硫酸酯和高硫高岩藻糖的低分子量岩藻聚糖硫酸酯,选用直流电刺激诱导大鼠颈动脉形成血栓模型,进行抗血栓活性的研究,并用有效抑制血栓效果剂量的岩藻聚糖硫酸酯对正常实验动物的凝血系统、纤溶系统和血小板系统进行分析,结合血小板的人体外实验,探讨中分子量岩藻聚糖硫酸酯和低分子量岩藻聚糖硫酸酯的作用机理,具体结果如下:
1)岩藻聚糖硫酸酯具有很好的抑制动脉血栓生成的活性,比较血管全阻塞时间发现,岩藻聚糖硫酸酯的分子量越大,抗血栓能力越强。0.1-0.25mg/kg的中分子量组分F1和F2能够显著地抑制血栓的生成,抑制血栓生成所需要的浓度显著低于肝素和低分子量岩藻聚糖。而2.5-10mg/kg低分子岩藻聚糖可以显著抑制抗血栓的生成,并且抗栓活性随着浓度的升高而升高。对血栓模型大鼠血浆中TXB2和6-keto-PGF1α的研究发现,中分子量岩藻聚糖硫酸酯F1和F2可以显著降低TXB2的含量,抑制血小板激活,但对内皮细胞分泌6-keto-PGF1α的影响不大。低分子量岩藻聚糖硫酸酯可以显著降低TXB2的含量,升高6-keto-PGF1α的含量,提高TXB2/6-keto-PGF1α的比值,二者共同作用抑制血小板激活,进而抑制血栓形成。中分子量岩藻聚糖硫酸酯和低分子量岩藻聚糖硫酸酯均可以提高血清中TFPI的含量,说明能够延长外源性凝血途径中的组织因子途径,从而抑制血栓的形成。
2)对正常大鼠注射具有抗栓效果的岩藻聚糖硫酸酯后,对血浆中APTT值、PT值、TT值、ATIII含量和FIB含量的比较发现,岩藻聚糖硫酸酯对APTT、TT有显著延长,而对PT和FIB含量没有影响,说明岩藻聚糖硫酸酯可以作用于内源凝血系统,而对外源凝血途径没有影响。低分子岩藻聚糖硫酸酯抗栓活性需要的浓度高于中分子量组分,其抗凝血活性也高于中分子量组分,尤其是LMWF4b延长APTT的作用极显著高于中分子量组分和低分子量的LMWF4a,活性随着浓度的增大而升高。岩藻聚糖硫酸酯对TT的延长效果低于肝素,而且无剂量关系。
3)对正常新西兰白兔注射具有抗栓效果的岩藻聚糖硫酸酯后发现,中分子量岩藻聚糖硫酸酯对t-PA、PAI均无显著影响,但是可以显著提高t-PA/PAI的百分比,对纤溶系统的激活作用尚待继续研究。低分子量岩藻聚糖硫酸酯体内可显著够缩短全血浆凝块溶解时间,LMWF4b可以降低优球蛋白溶解时间,并能够显著升高兔子血清中t-PA活性,提高t-PA/PAI的百分比,表明低分子量岩藻聚糖硫酸酯对纤溶途径还有激活作用。但所有岩藻聚糖硫酸酯对尿激酶型纤溶酶原激活物没有显著作用。
4)对人血小板的体外实验发现,岩藻聚糖硫酸酯对不同诱导剂诱导的血小板聚集的作用不同。中分子量岩藻聚糖硫酸酯F1和F2对ADP、从、凝血酶诱导的人血小板聚集无抑制作用,相反有促进血小板聚集的作用。低分子量岩藻聚糖硫酸酯都具有促进从的诱导的血小板的聚集作用,LMWF4a对ADP诱导血小板聚集的抑制活性显著大于LMWF4b,LMWF4b对凝血酶诱导的血小板聚集能力大于LMWF4a。
5)岩藻聚糖硫酸酯采用静脉注射给予正常大鼠后,大鼠血浆中血小板聚集的实验发现,中分子量岩藻聚糖硫酸酯F1和F2对ADP诱导的血小板聚集无影响,对从和凝血酶诱导的血小板聚集有促进作用。低分子量岩藻聚糖硫酸酯LMWF4a抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集活性大于LMWF4b,但是对AA诱导的血小板聚集有促进作用。
综上所述,海带中、低分子量岩藻聚糖硫酸酯具有显著的抗凝活性、纤溶活性和抗血小板聚集活性,具有重要的临床开发价,值得深入研究。
低分子量;岩藻聚糖硫酸酯;抗血栓活性;制备工艺
中国海洋大学
硕士
水产品加工及贮藏
李八方;赵雪
2011
中文
R284;R285.5
101
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）