噬菌体聚糖酶及其酶解产物的制备及性质研究

李淑营

中国海洋大学

摘要：

本文从Klebsiella K13及其专一性侵染噬菌体P13出发,对噬菌体P13的聚糖酶进行制备,以此为工具对Klebsiella K13的胞外多糖进行酶解得到酶解产物。并对噬菌体聚糖酶及其酶解产物的性质进行研究。
为提高Klebsiella K13胞外多糖产量,对其胞外多糖液体发酵的培养基组成及培养条件进行了优化。通过单因素试验和正交试验得出最佳培养基组成及培养条件如下:(1)最佳培养基组成为:10×盐溶液(g/L):Na2HPO4100,KH2PO430,NaCl10,MgSO4.7H2O2,CaCl2.2H2O0.01,FeSO4.7H2O0.01,K2SO410;葡萄糖30g/L,牛肉膏0.5g/L,蛋白胨0.5g/L,油酸1.5g/L。(2)最佳发酵参数为:初始pH7.0,温度24℃,装液量200ml/500mL,接种量10％,培养时间50h。以初始液体发酵培养基为对照,在上述优化培养条件下对Klebsiella K13进行液体发酵,细菌胞外多糖的产量达6.7 g/L,比条件优化前的产量(2.64 g/L)增加了153％。
通过对噬菌体P13侵染过程中菌液浓度、效价及酶活测定,确定噬菌体聚糖酶制备的最佳时间为噬菌体P13侵染后120min。利用丙酮提取法对噬菌体聚糖酶进行提取,并对最佳提取条件进行研究,发现添加1.5体积的预冷丙酮时提取效果最好。沉淀所得噬菌体聚糖酶使用100kD超滤离心管进行超滤离心后,采用Q-Sepharose FF柱层析进行初步纯化。以提取和纯化过程中的酶活性及效价变化为指示,分析了每一个提取和纯化步骤的效果,发现经过这些过程,噬菌体聚糖酶基本和杂蛋白分开。
以高度专一性侵染Klebsiella K13的噬菌体所分泌的噬菌体聚糖酶为工具,对Klebsiella K13胞外多糖进行降解,得到的酶解产物经Bio-Gel P4凝胶柱及Bio-Gel P6凝胶柱层析进行分离纯化,得到P1,P2,P3三个低分子量的组分。通过气相色谱分析对胞外多糖的单糖组分进行分析,发现此胞外多糖由葡萄糖、甘露糖和半乳糖三种单糖组成。借助于ESI-CID-MS分析,确定了各寡糖组分的分子量,并确定各片段分别为五糖、十糖、十五糖。经红外光谱分析,发现寡糖含有糖醛酸等特征官能团。通过一维核磁共振波谱分析和二维核磁共振波谱分析,初步确定了寡糖组分P1的基本结构。

关键词：克雷伯氏菌;噬菌体聚糖酶;酶解产物;制备工艺;液体发酵

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：水产品加工及贮藏工程

导师姓名：牟海津

学位年度：2011

语种：中文

分类号：Q814

页数：82

在线出版日期：2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）