利用高蛋白解脂亚罗维亚酵母转化菊粉生产单细胞蛋白的研究
近年来,用于食品和饲料的蛋白质需求量正在不断增加。单细胞蛋白生产技术为解决全球蛋白质短缺的问题提供了一条可行之路。单细胞蛋白的生产作为一个生物转化过程,将低成本的的原材料转变成了拥有高营养价值和市场价值的产品。而选择廉价的原料对于控制单细胞的蛋白生产的成本至关重要。菊粉作为植物的一种贮存性多糖,主要存在于如菊芋、菊苣、大丽花和雪莲果等植物的根茎中。作为一种可再生,廉价和来源丰富的原材料,菊粉资源得到越来越多的重视。这些优势使菊粉和含菊粉的植物成为SCP工业化生产的优质原材料。
从酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556中克隆的INU1基因连接到了分泌型表达质粒pINA1317,并且在高蛋白海洋酵母Yarrowia lipolytica SWJ-1b中得到表达。使原本不能分泌菊粉酶的Y.lipolytica SWJ-1b,能够直接利用菊粉生产单细胞蛋白。细胞生长80h后,重组菌株分泌的菊粉酶酶活达到了43.1±0.9U／ml。采用单次因子方法优化了产单细胞蛋白的最适培养基和最适条件,得到最适培养基组分为(w／v):菊粉4％,豆饼粉水解液4％,(NH4)2SO40.1％,初始pH为6。最佳培养条件为,在28℃和180 rpm振荡培养88h。在以上条件下培养,细胞干重达到19.5g／1,蛋白含量为38.7％(w／w),总蛋白量为7.54g／l。当该工程酵母菌在含有4.0％的菊粉(w／v)培养基中通过2-1发酵罐发酵72h后,细胞的粗蛋白含量、细胞干重、还原糖含量和总糖的利用率分别达到47.5％(w／w)、20.1g／l、0.6±0.1 g／l和96.4％(w／w)。当酵母工程菌在含有8％的菊芋(w／v)培养基中通过过2-1发酵罐发酵80h后,细胞的粗蛋白含量、细胞干重、还原糖和总糖的利用率分别达到53.7％(w／w)、20.8 g／l、1.3±0.2 g／l和94.2％(w／w)。所以,Y.lipolytica的重组菌株能够很好的利用菊粉以及含有菊粉的作物生产单细胞蛋白。
使用亲和层析法纯化了重组菊粉酶。SDS-PAGE结果表明纯化的重组菊粉酶的分子量约为84 kDa。纯化的重组菊粉酶最适作用温度为50℃,50℃以下具有良好的稳定性；最适作用pH为4.5,在pH5.0—9.5之间有良好的稳定性； Na+和Zn2+对其酶活有激活作用,Co2+、Ba2+、K+、Hg2+、Cu2+、Ag+和Ni2+对其酶活有抑制作用,其中Ag+和Hg2+表现出较强的抑制作用；蛋白抑制剂SDS对其酶活有较强的抑制作用；对菊粉的Km值为16.7mg／ml,Vmax为0.0052mg／min。重组菊粉酶能够将菊粉分解成单糖和部分寡糖,具有外切酶活性。
真核表达;单细胞蛋白;菊粉酶;海洋酵母;生物转化
中国海洋大学
硕士
微生物学
池振明
2011
中文
TQ936.2
94
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）